310 10 * 1mm Roestfrij stiel coiled buizen gemyske komponint, De N-terminale domeinen fan spidroin foarmje hydrogels basearre op amyloïde fibrillen en leverje in platfoarm foar proteïne-immobilisaasje.

Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.
Sliders dy't trije artikels per dia sjen litte.Brûk de efter- en folgjende knoppen om troch de dia's te bewegen, of de slide-controller-knoppen oan 'e ein om troch elke dia te bewegen.

Spesifikaasje

310 10 * 1mm RVS coiled buizen leveransiers

Gemyske gearstalling

Meganyske eigenskippen

Rekombinante spinne-seideproteinen (spider-silkproteins) hawwe in protte potensjele tapassingen yn 'e ûntwikkeling fan nije biomaterialen, mar har multimodale en aggregaasje-oanfallende natuer makket se lestich te krijen en maklik te brûken.Hjir melde wy dat rekombinante miniatuer spidroinproteinen en, wichtich, it N-terminale domein (NT) sels rap sels-stypjende en transparante hydrogels foarmje by 37 ° C.fusion aaiwiten besteande út NT en grien fluorescent aaiwyt of purine nucleoside phosphorylase foarmje folslein funksjonele fúzje aaiwiten.Hydrogels.Us resultaten litte sjen dat rekombinante NT- en fúzjeproteinen hege ekspresje-opbringsten leverje en hydrogels jouwe oantreklike eigenskippen lykas transparânsje, gelaasje sûnder crosslinking, en direkte immobilisaasje fan aktive aaiwiten by hege tichtheid.
Spinnen hawwe safolle as sân ferskillende sets siden klieren, elk produsearje in spesifyk soarte fan seide.Alle sân siden soarten binne gearstald út spinnesiden aaiwiten (spidroins) likernôch 6000 residuen lang en befetsje in grutte sintrale werhelling regio omjûn troch sfearyske N- en C-terminal domeinen (NT en CT) 1,2.De meast studearre soarte fan seide, de primêre ampulla, wurdt produsearre troch de primêre ampula-klier.Yn dizze klier syntetisearret in monolaach fan epitheliale sellen spidroïneproteinen en sekretearret se yn 'e lumen fan' e klier, wêr't se oanwêzich binne yn in oplosbere foarm (doping) by ekstreem hege konsintraasjes (30-50% w/v)3,4.De organisaasje en konformaasje fan 'e wichtichste ampullêre spidroinproteinen yn' e klier is debatearre, mar de measte eksperimintele bewiis jouwe oan op 'e oanwêzigens fan in algemien helical en / of willekeurige helical konformaasje en micellêre of lamellêre struktueren5,6,7,8,9,10.Wylst de repetitive domeinen regulearje meganyske eigenskippen fan seide fezels, it foarmjen fan β-sheet nanokristallen en amorfe struktueren11,12,13,14,15, eindomeinen regulearje seide fezels yn reaksje op feroarjende omstannichheden lâns de seide gland16,17,18.Troch it kontrolearjen fan seide formaasje, 19. Terminal domeinen wurde evolúsjonêr bewarre bleaun en har funksje kin mienskiplik wêze foar alle spidroinproteinen 2,20,21.By trochgong troch de klier nimt de pH fan spidroin ôf fan sawat 7.6 nei <5.716 en nimt ta mei skuorre en stretch bemiddele troch beweging troch it stadichoan fersmellende kanaal.Yn oplossing is CT in α-helikale konstitutyf parallelle dimer17, mar yn reaksje op lege pH en skuorkrêften ûntbrekt CT en skeakelet β-lagen16, 17, mooglik triggering β-lagen yn 'e repetitive regio's fan Convert 16. NT binne monomerysk ûnder betingsten dy't betingsten reflektearje yn 'e lumen fan' e klier en bemiddelje de oplosberens fan spidroin, mar by fermindere pH liedt protonaasje fan in oantal carboxylic acid side chains ta dimerisaasje fan NT mei in pKa fan likernôch 6.5, dêrmei stabilisearjen fan NT en fixing spidroin yn grutte hoeveelheden.netwurken16,18.Sa spilet NT in wichtige rol yn filamentfoarming, feroaret fan in monomer yn 'e coating nei in dimer yn' e fiber23,24,25.NT bliuwt heechoplosber en spiraalfoarmich ûnder alle betingsten dy't oant no ta studearre binne16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, dy't har ûntwikkeling ynspireare as in oplosberens-ferbetterjen label foar de produksje fan heterologe aaiwiten.
Rekombinant mini-spinneideproteïne, besteande út ien NT, ien koarte werhellingsregio, ien CT, en in His6-tag (His-NT2RepCT) foar suvering, is like oplosber yn wetterige buffer as lânseigen spin-seideproteïne en mimiket lânseigen wichtige skaaimerken fan siden spin .dekking 25.31.His-NT2RepCT kin wurde spûnen yn trochgeande fezels mei in biomimetyske masine wêryn in pH 8 oplosbere coating wurdt ekstrudearre yn in pH 525,32,33,34,35 wetterbad.Bioreactor fermentaasje fan E. coli ekspresje His-NT2RepCT en folgjende post-behanneling resultearre yn> 14 g / L opbringst nei suvering.De hege opbringst, hege oplosberens en adekwate reaksje fan His-NT2RepCT op soere omstannichheden wurde allegear taskreaun oan NT23, 25, 34.
Hjir melde wy de rappe formaasje fan transparante hydrogels út rekombinante spidroinproteinen, ynklusyf NT allinich, troch in proteïne-oplossing te ynkubearjen by 37 ° C.Mei help fan thioflavine T fluorescence (ThT), Fourier transformaasje ynfraread spektroskopy (FTIR), nukleêre magnetyske resonânsje spektroskopy (NMR) en transmissie elektronenmikroskopy (TEM), fûnen wy dat NT en mikrospider aaiwiten strukturele transformaasje ûndergeane yn β-blêden en amyloïde-like fibrillen as gels wurde foarme.Dêrnjonken foarmje fúzjeproteinen fan NT en grien fluorescent proteïne (GFP) of purine nucleoside phosphorylase (PNP) hydrogels mei folslein funksjonele fúzjefragminten.Hege-throughput-ekspresje yn heterologe hosts, kombinearre mei rappe formaasje fan hydrogels ûnder fysiologyske omstannichheden, iepenet de mooglikheid fan kosten-effektive produksje fan hydrogels mei yngenieurde funksjes.
Oars as de measte rapporteare rekombinante spidroinproteinen36, is His-NT2RepCT stabyl yn Tris-HCl-buffer by pH 8 en kin konsintrearre wurde oant 500 mg / ml sûnder delslach25.Dêrom wiene wy ​​ferrast om te finen dat dit proteïne rap optysk dúdlike, selsstypjende hydrogels foarmet as ynkubeare op 37 ° C (Fig. 1b-d).Fierdere stúdzjes lieten sjen dat His-NT2RepCT-gelaasje barde oer in breed oanbod fan proteïne-konsintraasjes (10-300 mg / ml) en dat dizze konsintraasje omkeard korrelearre wie mei gelaasjetiid (figuer 1c en oanfoljende fig. 1).Om út te finen hokker dielen fan His-NT2RepCT de formaasje fan hydrogel bemiddelje, ûndersochten wy elk domein dan yndividueel en yn ferskate kombinaasjes mei in flask-inversion-assay (figuer 1a, b).Alle hifke fraksjes fan rekombinante spidroin foarme gels (by in protein konsintraasje fan 300 mg / ml) yn minder as 1 h, útsein foar precipitated 2Rep (Fig. 1b).Dit suggerearret dat NT en CT allinich, yn kombinaasje, of assosjearre mei werhellingen, by 37 ° C gel kinne en dat de His6-tag dit proses net yn signifikante mjitte beynfloedet.Sjoen it mienskiplike begryp dat NT in heul oplosber en stabyl proteïne is, en dat eardere rapporten fan rekombinante spidroin-hydrogels gelaasje-effekten hawwe taskreaun oan konformaasjewizigingen yn werhellende regio's en / of CT's, koe NT sels.De ûntdekking fan gelaasje wie ûnferwachts.Oanfoljende Tabel 1) 37, 38, 39. Opfallend is dat NT al binnen 10 minuten gel gelearre by in konsintraasje fan ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Vial inversion eksperiminten mei ferskate konsintraasjes fan NT lieten sjen dat by> 50 mg / mL de NT oplossing flugger gelled as His-NT2RepCT by de oerienkommende konsintraasje (w / v, figuer 1c).
Skematyske fertsjintwurdiging fan ferskate spidroin-konstruksjes dy't yn dit wurk studearre.b Geltiid by 37 ° C foar ferskate rekombinante spidroinproteinen (300 mg / ml) ferifiearre troch it omkearjen fan 'e fial.CT-gel fuortendaliks sûnder ynkubaasje (<300 mg/mL), 2Rep-precipitates (300 mg/mL, 5 mm skaal).c Geltiid fan His-NT2RepCT en NT by oanjûne proteïnekonsintraasjes by 37 °C.d Foto's fan His-NT2RepCT en NT hydrogels mei respektivelik de spin en de letter "NT" ûnder printe (beide 200 mg / ml, skaalbalke 5 mm).
Hydrogels foarme troch ferskate rekombinante spidroin aaiwiten hawwe in bytsje ferskillende kleuren, en bleate each observaasje toant wikseljende graden fan transparânsje (figuer 1b).NT-gels binne útsûnderlik dúdlik, wylst oare gels ûntrochsichtich wurde.His-NT2RepCT en NT gels getten yn silindryske buizen koe wurde fuorthelle út de mal yntakt (figuer 1d).
Om te testen oft natuerlike spinsidecoatings gelearje ûnder betingsten dy't no fûn wurde dat se gelaasje fan 'e rekombinante spidroinproteinen feroarsaakje, waarden coatings sammele út 'e grutte ampulaklier fan 'e Sweedske brêgespin (Larinioides sclopetarius).Coatings waarden opslein yn 20 mM Tris-HCl-buffer by 50 mg / ml (basearre op mjitten droech gewicht), mar gjin gelaasje waard beoardiele tidens de 21-dagen-ynkubaasje by 37 ° C (oanfoljende figuer 2a).
Om dizze gels te kwantifisearje kinne rheologyske mjittingen wurde brûkt om it gelaasjeproses te studearjen en de algemiene meganyske eigenskippen te bepalen.Benammen it kontrolearjen fan de opslachmodulus (elastisiteit) by ferhege temperatueren kin ynformaasje jaan oer de gelende temperatuer lykas de viskoelastyske eigenskippen fan 'e coating.Eksperiminten mei temperatuerferheging (gebrûk fan 1 ° C / min by 25-45 ° C, basearre op eardere stúdzjes mei help fan natuerlike seide stock-oplossingen)40,41 lieten sjen dat de opslachmoduli fan His-NT2RepCT- en NT-oplossingen tanommen mei tanimmende temperatuer.waard ferhege (figuer 2 en oanfoljende figuer 3).Opmerklik begon de NT-module te groeien op in legere temperatuer yn ferliking mei His-NT2RepCT, yn oerienstimming mei de rappere geltiid waarnommen doe't NT direkt ynkubeare mei His-NT2RepCT by 37 ° C (figuer 1).Nei in folgjende delgong yn temperatuer kaam de opslachmodulus net werom nei legere wearden en bleau boppe de ferliesmodulus (sjoch Oanfoljende Fig. 3), wat oanjout op thermysk ûnomkearbere stabile gelaasje.Nei gelaasje farieare de lêste elastyske modulus fan 15 oant 330 kPa foar His-NT2RepCT-hydrogels by in konsintraasje fan 100-500 mg / mL, en de lêste elastyske modulus foar NT-hydrogels (100-500 mg / mL) rûn fan 2 oant 1400 kPa (figuer, 2 en folsleine ramp data) sjoch oanfoljende figuer 3).
a Feroaring yn temperatuer by mjittingen fan His-NT2RepCT (300 mg / ml) en b NT (300 mg / ml) mei skodzjen.De pylken jouwe de temperatuertrend oan, en de lichtere skaad fan 'e gegevens fan' e opslachmodule ferbyldet testen op legere koppelwearden foar it ynstrumint dan oantsjutte troch de fabrikant, wat de oarsaak is fan it ferhege lûd.c Einmodule-akkumulaasje fan His-NT2RepCT en NT nei ferhege temperatuer (100, 300 en 500 mg / mL).Alle modullêzingen wurde nommen op in frekwinsje fan 0,1 Hz.
As potinsjele metoade foar it ûndersykjen fan konformaasjewizigingen ferbûn mei gelaasje, hawwe wy FTIR-spektra fan His-NT2RepCT en NT opnommen foar en nei gelaasje by 37 ° C (figuer 3a, b).Lykas ferwachte, kamen de spektra fan His-NT2RepCT- en NT-oplossingen oerien mei proteïnen dy't α-helix / willekeurige spoel sekundêre struktuer sjen litte, mei in útsprutsen band op 1645 cm-1.Foar beide hydrogels resultearre gelation yn de foarming fan twa earms yn 'e midden I band op likernôch 1617 cm-1 en 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), wat oanjout de foarming fan antiparallel β-sheet struktueren.Dizze feroarings kinne ek dúdlik te sjen yn de respektivelike twadde derivative en ferskil gelation spektra (oanfoljende Fig. 4b).De twa bands fan de NT β-laach wiene mear útsprutsen as dy fan His-NT2RepCT, wat oanjout dat de totale ynhâld fan β-laach bands yn de NT hydrogel wie heger as dy fan de NT2RepCT hydrogel.
in FTIR-absorptionsspektra fan His-NT2RepCT en b NT (beide 500 mg / ml) foar (oplossing) en nei (gel) ynkubaasje by 37 ° C.c TEM bylden fan resuspended 50 mg / ml NT2RepCT gels en d NT.Skaalbalke 200 nm.e Fiberdiameters fan His-NT2RepCT en NT hydrogels.n = 100 mjitten fibrillen, p < 0,0001.De flaterbalken litte de standertdeviaasje sjen.It sintrum fan 'e flaterbalken is it gemiddelde.In unpaired t-test (twa-tailed) waard brûkt foar statistyske analyze.f ThT-fluoreszinsje fan ferskate rekombinante spidroinproteinen (100 mg / ml) by 37 ° C sûnder skodzjen.g NT (100 mg / ml) ynokulaasje eksperiminten út 100 mg / ml NT gel mei 0%, 5%, 10%, en 20% sied.
Analyse fan 'e gel mei help fan transmissieelektronenmikroskopie (TEM) die bliken dat de hydrogel bestiet út amyloïde-like fibrillen (fig. 3c, 3d).NT-foarme fibrillen waarden ferlingd (5-12 nm yn diameter) en unbranched, wylst His-NT2RepCT fibrils wiene koarter yn lingte en signifikant breder yn diameter (7-16 nm) (Fig. 3e).Dizze resultaten lieten ús de kinetika fan fibrosis folgje mei de thioflavine T (ThT) assay.Foar alle rekombinante spidroinproteinen fergrutte it fluorescent sinjaal doe't samples op 37 ° C ynkubearre waarden (Fig. 3f, Supplementary Fig. 5a).Yn oerienstimming mei dizze fynst liet mikroskopysk ûndersyk fan NT en His-NT2RepCT ûnder gelearjende omstannichheden in unifoarme ferheging fan ThT-fluoreszinsje sjen sûnder merkbere lokale accumulation fan ThT-positive aggregaten (Supplementary Fig. 5b, c).De formaasje fan ThT-positive fibrillen waard net begelaat troch in ferheging fan NT en His-NTCT turbiditeit (Supplementary Fig. 5d), dat betsjut dat in netwurk fan fibrillen yn 'e gel koe foarmje sûnder kompromissen gel dúdlikens.Sieden troch it tafoegjen fan lytse hoemannichten foarfoarme fibrillen kin de fibrilfoarming fan guon amyloïden42,43,44 signifikant versnellen, mar it tafoegjen fan 5%, 10% of 20% (w / w) NT oan in oplossing fan NT hydrocoagulants.siedingseffekt (fig. 3g).Miskien komt dit troch it feit dat de fibrillen yn 'e hydrogel relatyf fêst binne en kinne net brûkt wurde as sied.
It ûnferwachte gedrach fan rekombinante spidroinproteinen by hege temperatueren soarge foar fierdere nukleêre magnetyske resonânsje (NMR) spektroskopystúdzjes om konformaasjewizigingen te identifisearjen ferbûn mei gelfoarming.NMR-spektra fan His-NT2RepCT-oplossingen opnommen yn 'e rin fan' e tiid by 37 ° C lieten sjen dat CT noch foar in part fold wie, wylst NT- en 2Rep-sinjalen ferdwûn wiene (fig. 4a), wat suggerearret dat it benammen NT en 2Rep wie dy't foar in part kontroleare formaasje fan His- NT2RepCT hydrogel.It CT-sinjaal waard ek ôfswakke oant 20% fan syn oarspronklike yntensiteit, wat suggerearret dat CT ek meast fêst is en yn 'e hydrogelstruktuer opnommen is.Foar in lytser diel fan 'e CT, dy't sa mobyl is as yn' e preinkubearre stekproef en dus beoardiele troch oplossing NMR, ûntbrekke de spektra sinjalen foar de earste 10 strukturearre residuen, mooglik troch drege immobilisaasje fan it taheakke diel fan His-NT2Rep.De NMR-spektra fan 'e -state fan hydrogels -NT2RepCT lieten de oerhearskjende oanwêzigens fan α-helices en β-lagen en, yn mindere mjitte, de willekeurige spoelkonformaasje (fig. 4b).Gemyske ferskowingsanalyse fan methionine-residuen dy't allinich yn NT oanwêzich binne lieten sjen dat dit domein omboud wie ta in β-blêdstruktuer.De tiid-ôfhinklike spektra fan NT yn oplossing toande in unifoarme ôfnimming fan sinjaal yntinsiteit (Fig. 4c), en fêste-state NMR fan NT hydrogels liet sjen dat de measte fan de NT-residuen waarden omboud ta β-sheet struktueren (Fig. 4d).De konformaasje fan 2Rep koe net apart wurde bepaald fanwegen syn oanstriid om te aggregearjen.De fêste steat NMR-spektra fan 'e NTCT- en His-NT2RepCT-hydrogels seagen lykwols heul gelyk (Fig. 4b; Oanfoljende Fig. 6b), wat suggerearret dat 2Rep net folle bydroegen oan it strukturele diel fan 'e His-NT2RepCT-hydrogel.Foar CT-hydrogels, α-helices, β-blêden en willekeurige helical sekundêre struktueren waarden fûn te bestean (Supplementary Fig. 6d).Dit suggerearret dat guon dielen fan 'e CT α-helices bliuwe, wylst oaren β-blêden wurde.Sa suggerearje de resultaten fan NMR-spektroskopie dat NT wichtich is foar hydrogelfoarming en ek transformearret yn in β-blêdkonformaasje by fúzje mei 2Rep en CT.Yn oerienstimming mei dit hawwe wy koartlyn fûn dat amyloïde romtlike ritsen wierskynlik foarmje yn alle fiif helices fan it NT-domein, en it Waltz-algoritme foarsei in amyloidogenyske regio yn helix 1 (Fig. 4e).
2D-spektra fan 15N-HSQC 10 mg / ml His-NT2RepCT-oplossing foar (blau) en 19 oeren nei ynkubaasje (read) by 37 ° C.Yndividuele krúspieken yn it reade spektrum en F24, G136, polyA yn it blauwe spektrum wurde oanjûn troch inkele letter aminosoerensymboalen en residunûmers.De ynsetten litte de ôfhinklikens fan 'e sinjaalintensiteit op' e tiid sjen foar selekteare residuen fan 'e NT-, 2Rep- en CT-domeinen.b Solid-state radiofrequency (RFDR) spektra fan His-NT2RepCT hydrogels.Korrelaasjes fan Cα / Cβ-residuen waarnommen yn RFDR-spektra waarden bepaald troch ferliking mei gemyske ferskowings fan modelpeptide en wearden ôflaat fan statistyk82,83 en har sekundêre struktueren.SSB - draaiende sydbân.c Iendimensjonale spektra fan 15N-HSQC 10 mg / ml NT-oplossing tidens ynkubaasje by 37 ° C foar 36 oeren.De ynset toant volumetryske yntensiteit tsjin tiid.d Solid state RFDR spektra fan NT hydrogels.De korrelaasjes fan Cα / Cβ-residuen en har sekundêre struktueren beoardiele yn 'e RFDR-spektra wurde oanjûn.e Basearre op it NT45.79 fibrillaasjeprofyl fan 'e Zipper-database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).De Rosetta-enerzjy fan it romtlike bliksemferskowingfinster fan it hexapeptide wurdt werjûn yn kcal / mol.Reade balken jouwe hexapeptiden oan mei in hege fibrosis oanstriid (Rosetta enerzjy ûnder -23 kcal / mol; ûnder de stippelline).Griene balken jouwe fragminten oan mei Rosetta-enerzjes boppe de drompel en dêrom minder wierskynlik steryske ritsen te foarmjen.Fragminten mei proline waarden útsletten fan 'e analyze (sûnder kolommen).Pleatsen jouwe gebieten fan amyloïdose oan foarsein troch it Waltz-algoritme81 (https://waltz.switchlab.org).De folchoarder fan aminosoerenresiduen fan NT is oan 'e boppekant, en de soarten residuen fûn yn' e β-sekundêre struktuer (bepaald troch solid-state NMR-spektroskopy) wurde yn read toand.De posysjes fan de fiif NT α-helices wurde oanwiisd as (H1-H5)28.
By pH <6.5 dimerisearret HT, en is resistint foar waarmte- of urea-induzearre denaturaasje18.Om te ferklearjen hoe't NT-dimerisaasje en stabiliteit beynfloedzje gelaasje, waarden oplossingen mei 100 mg / ml NT kontrolearre op pH 8, 7 en 6 mei de fial-inversiontest.NT-samples ynkubearre by pH 8 en 7 gelden nei 30 min by 37 ° C, mar de pH 8-gel bleau dúdlik, wylst de pH 7-gel in sichtbere precipitaat toande (Fig. 5a).Yn tsjinstelling, in oplossing mei HT by pH 6 foarme gjin gel, en in grutte delslach koe sjoen wurde nei 20 min by 37 ° C.Dit suggerearret dat dimers sels en / of har hegere stabiliteit yn ferliking mei monomeren gelaasje foarkomme.De formaasje fan in delslach foar NT by pH 7 en 6 waard net ferwachte, om't it is rapportearre dat NT oplosber is by 200 mg/ml27, maklik opnij foltôget nei waarmte denaturaasje, en ek in α-helix behâldt by legere wearden fan pH 18. In wierskynlike ferklearring foar dizze ferskillen is dat dat de earder rapportearre eksperiminten waarden útfierd by keamertemperatuer of ûnder, of op relatyf lege protein konsintraasjes16,18,19.
NT vial inversion test (100 mg / mL) by pH 8, 7, 6 en 154 mM NaCl (pH 8) nei ynkubaasje by 37 ° C.b NT CD-spektra mei en sûnder respektivelik 154 mM NaF en 154 mM NaCl.Molêre elliptisiteit by 222 nm wurdt omsetten yn in oanpart fan natuerlike plooien.c NT-inversion-assay (100 mg/mL) NT* (37 °C en 60 °C), NTA72R (37 °C), en His-NT-L6 (37 °C en 60 °C).d CD-spektra fan NT-mutanten NT*, NTA72R, en His-NT-L6.Molêre elliptisiteit by 222 nm wurdt omsetten yn in oanpart fan natuerlike plooien.e Inversion test fan NTFlSp, NTMiSp en redusearre NTMiSp (100 mg / ml).Skaalbalke 5 mm.f CD-spektra fan NT, NTFlSp, NTMiSp en redusearre NTMiSp.Molêre elliptisiteit by 222 nm wurdt omsetten yn in oanpart fan natuerlike plooien.Folsleine NT-spektra by 25 °C en 95 °C wurde werjûn yn oanfoljende figuer 8.
Fysiologyske sâltkonsintraasje bepaalt elektrostatyske ynteraksjes tusken NT-subunits en dimerisaasje fan NT-oerdracht nei legere pH18.Wy fûnen dat de oanwêzigens fan 154 mM NaCl en NaF yndied gelaasje ynhibearre, respektivelik (Fig. 5a, b; Oanfoljende Fig. 2b) en dat dizze sâlten de thermyske stabiliteit fan NT-monomeren fergrutte (Fig. 5b, Oanfoljende Fig. 8) .It suggerearret ek dat ferbettering fan stabiliteit, ynstee fan dimerisaasje, gelfoarming foarkomt.
Om de rol fan proteïndimerisaasje en stabiliteit yn gelaasje fierder te ûndersiikjen, brûkten wy twa mutanten, NT * en NTA72R, dy't ek monomerysk bliuwe by lege pH28.30.NT * is in dûbele lading omkearing mutant wêryn de skynbere dipolêre lading distribúsje fan it monomer wurdt plat, dy't foarkomt dimerization en drastysk fergruttet monomer stabiliteit.NTA72R is in opladen dipole, mar Arg-substituearre Ala leit oan 'e dimergrins, sadat mutaasjes interferearje mei subunit-ynteraksjes dy't nedich binne foar dimerisaasje.By ynkubaasje by 37 ° C foarme NT * gjin hydrogel, wylst NTA72R in opake gel foar 15 min foarme (fig. 5c).Sûnt sawol NT * en NTA72R kin net dimerize, mar ferskille yn monomer stabiliteit (fig. 5d), dizze resultaten sterk suggerearje dat hege termodynamyske stabiliteit foarkomt NT út gelling.Dit wurdt ek stipe troch it feit dat HT* in gel foarmet as it op hege temperatuer ynstabyl is (nei 8 min by 60 ° C; Fig. 5c).It is earder oantoand dat de hege ynhâld fan methionine yn NT syn natuerlike folding vloeibaar makket en dat seis Met to Leu-substituten (hjir oantsjutten as His-NT-L6) it NT46-monomeer sterk stabilisearje.Op grûn fan 'e oanname dat strukturele fleksibiliteit fereaske is foar NT-gelfoarming, fûnen wy dat de His-NT-L6 stabile mutant net gel by 37 ° C (figuer 5c, d).His-NT-L6 foarme lykwols ek in gel by ynkubaasje by 60 ° С foar 60 min (fig. 5c).
It fermogen fan NT om te transformearjen yn β-blêdstruktueren en hydrogels te foarmjen liket fan tapassing te wêzen op guon mar net alle NT-domeinen fan spidroin.NTs út ferskillende siden soarten en spin soarten, Trichonephila clavipes (NTFlSp), foarme gels nettsjinsteande harren relatyf lege methionine ynhâld en hege termyske stabiliteit (figuer 5e, f en oanfoljende tabel 2).Yn tsjinstelling, NT út de lytse ampullar protein spidroin út Araneus ventricosus (NTMiSp) mei lege termyske stabiliteit en hege methionine ynhâld net foarmje hydrogels (oanfoljende tabel 2 en Fig. 5e, f).Dat lêste kin wurde assosjearre mei de oanwêzigens fan intramolekulêre disulfide obligaasjes29,47.Konsekwint, doe't de disulfidebindingen fan NTMiSp fermindere waarden, foarme it in hydrogel nei ynkubaasje by 37 ° C foar 10 min (Fig. 5e).Ta beslút, it moat wurde opmurken dat strukturele fleksibiliteit is in wichtich, mar net de ienige, kritearium foar de foarming fan in gel út NT.In oare faktor dy't relevant kin wêze is de oanstriid om amyloïde fibrillen te foarmjen, en analyse mei de ritsdatabank en it Waltz-algoritme liet in korrelaasje sjen tusken it fermogen om gels te foarmjen en de oanwêzigens fan amyloidogenyske regio's, lykas ek de omfang fan 'e regio's foarsein. om steryske ritsen te foarmjen.Der wie in korrelaasje (oanfoljende tabel 2 en oanfoljende fig. 9).
It fermogen fan NT om fibrillen te foarmjen en gels te foarmjen ûnder geunstige omstannichheden late ús om te hypoteze dat NT-fúzjes mei oare proteinfragminten noch gels kinne foarmje mei folsleine funksje fan fúzjepartners.Om dit te testen, yntrodusearren wy respektivelik grien fluorescent proteïne (GFP) en purine nucleoside phosphorylase (PNP) oan 'e C-terminus fan' e NT.De resultearjende fúzjeproteïnen waarden útdrukt yn E. coli mei heul hege definitive opbringsten (150 mg / L en 256 mg / L shake flask kultueren foar respektivelik His-NT-GFP en His-NT-PNP), yn oerienstimming mei wat is oanjûn foar Oare aaiwiten fusearre oan NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg / mL) en His-NT-PNP (100mg / mL) fúzjeproteinen foarmen gels nei 2 oeren en 6.5 oeren by 37 ° C en, wichtich, bleau de GFP-fraksje net feroare.waarnommen nei gelation, mei> 70% fan de earste fluorescence yntinsiteit oerbleaune nei gelation (Fig. 6a).Om PNP-aktiviteit te mjitten yn syn-NT-PNP-oplossingen en gels, moasten wy it fúzjeproteïne mei NT ferwiderje, om't de enzymatyske aktiviteit fan 'e suvere tarieding bûten it deteksjeberik fan' e assay wie by gelkonsintraasjes.De gel foarme mei in mingsel mei 0.01 mg / ml His-NT-PNP en 100 mg / ml NT behâlde 65% fan 'e earste enzymatyske aktiviteit fan' e preinkubearre samples (figuer 6b).De gel bleau yntakt by de mjitting (oanfoljende Fig. 10).
a Relative fluorescensintensiteit foar en nei gelaasje fan His-NT-GFP (300 mg / ml) en omkearde fial mei His-NT-GFP hydrogel (300 mg / ml) ûnder sichtber en UV-ljocht.Punten litte yndividuele mjittingen sjen (n = 3), flaterbalken litte standertdeviaasje sjen.De gemiddelde wearde wurdt werjûn yn it sintrum fan 'e flaterbalken.b PNP aktiviteit waard krigen troch fluorometric analyze mei help fan oplossings en gels besteande út NT (100 mg / ml) en in mingsel befettet 0,01 mg / ml his-NT-PNP en 100 mg / ml Nij Taiwan dollar.De ynset lit in omkearde flesje sjen mei in hydrogel mei His-NT-PNP (5 mm skaalbalke).
Hjir melde wy de formaasje fan hydrogels fan NT en oare rekombinante spidroinproteinen troch in proteïne-oplossing te ynkubearjen by 37 ° C (figuer 1).Wy litte sjen dat gelaasje ferbûn is mei de transformaasje fan α-helices yn β-lagen en de formaasje fan amyloïde-like fibrillen (figueren 3 en 4).Dizze fynst is ferrassend, om't NT's bolfoarmige bolfoarmige fiif-helix bondels binne bekend om har ekstreem hege oplosberens en hege stabiliteit by konsintraasjes> 200 mg / ml by 4 ° C foar ferskate dagen27.Derneist folden NT's maklik opnij nei waarmtedenaturaasje by lege proteïnekonsintraasjes yn µM.Neffens ús resultaten fereasket fibrilfoarming in kombinaasje fan> 10 mg / ml proteinkonsintraasje en wat ferhege temperatuer (figuer 1).Dit is konsekwint mei it idee dat amyloïde fibrillen kinne foarmje út globularly folded proteins dy't yn in foar in part ûntfolde steat binne troch termyske fluktuaasjes ûnder fysiologyske omstannichheden 48 .Foarbylden fan aaiwiten dy't dizze konverzje ûndergeane binne insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin en lysozyme51,52,53.Hoewol NT is in α-helix yn syn memmetaal steat, likernôch 65% fan 'e polypeptide keten is kompatibel mei steric rits formaasje (Fig. 4e) 45 .Sûnt it monomer dynamysk mobyl is46, kin it dizze potinsjele amyloidogenyske regio's bleatstelle by matig ferhege temperatueren en by hege konsintraasjes fan totale proteïne kin in krityske konsintraasje berikke foar amyloïde fibrilformaasje54.Nei dizze redenearring fûnen wy in negative korrelaasje tusken spidroin-konsintraasje en gelaasjetiid (fig. 1c), en as de monomere NT-konformaasje stabilisearre wurdt troch mutaasjes (NT*, His-NT-L6) of troch sâlttafoeging, kin it foarkommen fan de formaasje hydrogels (figuer 5).
Yn 'e measte gefallen ferdwine amyloïde fibrillen út' e oplossing as in delslach, mar ûnder bepaalde betingsten kinne se hydrogels foarmje55,56,57.Hydrogel-foarmjende fibrillen hawwe typysk in hege aspektferhâlding en foarmje stabile trijediminsjonale netwurken troch molekulêre ferstriken, 55,58 yn oerienstimming mei ús resultaten.Foar hydrogelfoarming in vitro wurde aaiwiten faak folslein of foar in part ûntfold, bygelyks troch bleatstelling oan organyske solvents, hege temperatuer (70-90 ° C) en / of lege pH (1.5-3.0) 59,60,61,62.De hjir beskreaune spidroin-hydrogels hawwe gjin hurde ferwurking nedich, en se hawwe ek gjin cross-linkende aginten nedich om de hydrogels te stabilisearjen.
It is earder rapportearre dat spidroin werhellet en QD's, dy't lykje te wikseljen fan β-blêd ûnder seide spinnen, foarmje hydrogels.Yn ferliking mei ús befiningen wiene ynkubaasjetiden en / of ynkubaasjetemperatueren respektivelik signifikant langer of heger, en de resultearjende hydrogels wiene faak ûntrochsichtich (figuer 7 en oanfoljende tabel 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Neist snelle geltiden, NT-hydrogels> 300 mg / ml (30%) prestearren alle oare beskreaune rekombinante spider-seideproteinhydrogels, lykas natuerlike hydrogels lykas gelatine, alginate (2%), agar (0,5% ) en kollagen.(0,6%) (figuer 7 en oanfoljende tabellen 1 en 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
De geltiid en elastyske modulus fan 'e hydrogels yn dizze stúdzje waarden fergelike mei oare spidroin-basearre hydrogels en selektearre natuerlike hydrogels.Referinsjes wurde jûn tegearre mei in beskriuwing fan de gelation betingsten.APS Ammoniumpersulfat, keamertemperatuer.Gegevens 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Spinnen lykje manieren te hawwen ûntwikkele om spidroin te foarkommen fan gelearjen by opslach.Nettsjinsteande de hege konsintraasje fan proteïne yn 'e seide klier betsjut de grutte werhellingsregio ferbûn mei it terminaldomein dat de skynbere konsintraasje fan NT en CT yn' e klier oerienkomt mei likernôch 10-20 mg / ml, oan 'e grins fan dizze stúdzje.nedich foar in vitro waarnommen hydrogel formaasje.Dêrneist stabilisearre ferlykbere konsintraasjes fan sâlten 16 NT, lykas yn seide klieren (figuer 5b).NT-konformaasje is studearre yn 'e E. coli-cytosol en fûn dat se strak fold binne as by ûndersocht yn vitro, wat fierder oanjout dat sâlt of oare faktoaren har aggregaasje yn vivo foarkomme.It fermogen fan NT's om te transformearjen yn β-blêdfibrillen kin lykwols wichtich wêze foar filamentfoarming en moat ûndersocht wurde yn takomstige stúdzjes.
Neist de nije aspekten fan NT-amyloïde-like fibril- en hydrogelfoarming dy't yn dizze stúdzje beoardiele wurde, litte wy ek sjen dat dit ferskynsel biotechnologyske en biomedyske tapassingen hawwe kin (fig. 8).As bewiis fan konsept kombinearren wy NT mei GFP of PNP en lieten sjen dat it fúzjeprotein ek hydrogels foarmet as ynkubeare op 37 ° C en dat de GFP- en PNP-fraksjes har aktiviteit foar it grutste part behâlde nei gelaasje (figuer 6).Nucleoside phosphorylases binne wichtige katalysatoren synteze fan nucleoside analogen75, wat ús ûntdekking relevant makket foar de biofarmaseutyske yndustry.It konsept fan it ekspresje fan fúzjeproteinen dy't transparante hydrogels foarmje ûnder geunstige omstannichheden makket it meitsjen fan funksjonalisearre hydrogels mei geunstige eigenskippen foar in breed oanbod fan tapassingen, lykas enzyme-immobilisaasje, kontroleare medisynfrijlitting en tissue-technyk.Dêrnjonken binne NT en NT* effisjinte ekspresjemarkers30, wat betsjut dat NT en har farianten kinne wurde brûkt foar produksje mei hege trochset fan oplosbere fúzjeproteinen en dêropfolgjende skepping fan ymmobilisearre doelproteinen yn 3D hydrogels.
NT is oplosber, α-helikaal en stabyl by lege konsintraasjes (µM) en 37 ° C.By deselde temperatuer, mar by tanimmende konsintraasjes (>10 mg/ml), foarmet NT gels besteande út amyloïde-like fibrillen.NT-fúzjeproteinen foarmje ek fibrillêre gels mei folslein funksjonele fúzjefragminten, wêrtroch ferskate aaiwiten kinne wurde immobilisearre yn 3D hydrogels mei NT.Bottom: NT (PDB: 4FBS) en yllustraasjes fan glêstried netwurken en assosjearre aaiwyt struktueren (oannommen en net tekene op skaal, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210 / pdb2B3Q / pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210 / pdb4RJ).
De konstruksjes (sjoch Oanfoljende Tabel 4 foar in folsleine list mei aminosoerensekwinsjes) waarden klonearre yn plasmid pT7 en omfoarme ta E. coli BL21 (DE3).E. coli mei yngenieurde plasmiden waarden ynokulearre yn Luria-bouillon oanfolle mei kanamycin (70 mg / l) en groeide oernacht by 30 ° C en 250 rpm.De kultuer waard dan 1/100 ynokulearre yn LB-medium mei kanamycin en yn kultuer brocht by 30 ° C en 110 rpm oant de OD600 berikte 0.8.Foar NMR-stúdzjes waarden baktearjes groeid yn M9 minimaal medium mei 2 g D-glucose 13C (Aldrich) en 1 g ammoniumchloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) foar protein-labeling mei isotopen.Ferleegje de temperatuer nei 20 graden Celsius en induce protein ekspresje mei 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (ein konsintraasje).Nei oernachte proteïne-ekspresje waarden sellen rispe by 7278 × g, 4 ° C foar 20 min.Selpellets waarden opnij suspendearre yn 20 mM Tris-HCl, pH 8, en beferzen oant fierder gebrûk.Ontdooide sellen waarden lysed mei in sel disruptor (TS-serie masines, Constant Systems Limited, Ingelân) by 30 kPa.Dêrnei waarden de lysaten foar 30 minuten by 4 ° C sintrifuge op 25.000 g.Foar NTMiSp waard de pellet dan opnij suspendearre yn 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, en sonicated foar 2 min (2 s oan / út, 65%), dan wer sintrifugeare by 25.000 xg, 4 ° C. binnen 30 min.De supernatant waard laden op in Ni-NTA-kolom, wosken mei 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8, en úteinlik waard it proteïne elutearre mei 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8. Om NT2RepCT te generearjen en NTCT, thrombinedigestion yntrodusearret de side (ThrCleav) tusken His en NT.Thrombine-splitsingsplakken binne ek oanwêzich yn His-NT-ThrCleav-2Rep (produsearret 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produsearret NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produsearret CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produsearret NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produsearret NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produsearret NTF1Sp), en His-Ssulfur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produsearret NTMiSp).De konstruksjes waarden digested mei trombine (1: 1000) en dialyzed oernachtich by 4 ° C. mei 20 mM Tris-HCl, pH 8, mei help fan in Spectra / Por dialysis membraan mei in molekulêre gewicht drompel fan 6-8 kDa.Nei dialyse wurdt de oplossing op in Ni-NTA-kolom laden en wurdt it effluent mei it proteïne fan belang sammele.Proteinkonsintraasjes waarden bepaald troch UV-absorbânsje te mjitten by 280 nm mei de útstjerkoëffisjint fan elk proteïne, útsein NTF1Sp, dy't de Bradford-assay brûkte neffens it protokol fan 'e fabrikant.Suverens waard bepaald troch SDS polyacrylamide (4-20%) gelelektroforese en Coomassie briljante blauwe kleuring.Proteins waarden konsintrearre mei help fan centrifuge filters (VivaSpin 20, GE Healthcare) by 4000 xg mei in 10 kDa molekulêre gewicht cutoff yn 20 minuten syklusen.
Taai de proteïne-oplossing en pipet 150 µl foarsichtich yn in 1 ml dúdlike septumfles (8 x 40 mm Thermo Scientific).De buizen waarden ôfsletten en ôfsletten mei parafilm om ferdamping te foarkommen.Samples (n = 3) waarden ynkubeare by 37 ° C of 60 ° C en periodyk omkeard om gelaasje te observearjen.Samples dy't net gel wiene ynkubeare foar op syn minst ien wike.Ferminderje NTMiSp disulfide obligaasjes mei 10 mM DTT per 10 µM proteïne.Om de gelaasje te analysearjen fan natuerlike spiderseide-coatings, waard de Sweedske brêgespin ôfsnien, de twa wichtichste ampulearre klieren waarden pleatst yn 200 μl fan 20 mM Tris-HCl-buffer pH 8 en snijden om de coating te skieden fan 'e klieren..De ynhâld fan 'e klieren wurdt oplost yn buffer, 50 µl foar bepaling fan droech gewicht (troch inkubaasje fan iepen fiolen by 60 ° C oant konstant gewicht) en 150 µl foar gelaasje by 37 ° C.
De mjitmjitting / ark is makke fan roestfrij stiel mei in parallelle plaat mei in topdiameter fan 20 mm en in gat fan 0,5 mm.Ferwaarmje it probleem fan 25 °C oant 45 °C en werom nei 25 °C mei in snelheid fan 1 °C per minuut mei in Peltier-plaat fan roestfrij stiel.Vibrasjonele mjittingen waarden útfierd op in frekwinsje fan 0,1 Hz en yn 'e lineêre viskoelastyske regio fan it materiaal by in spanning fan 5% en 0,5% foar samples fan respektivelik 100 mg / ml en 300-500 mg / ml.Brûk in oanpaste fochtige keamer om ferdamping te foarkommen.Gegevens waarden analysearre mei Prism 9.
Foar it sammeljen fan ynfraread (IR) spektra by keamertemperatuer fan 800 oant 3900 cm–1.It ATR-apparaat, lykas it ljochtpaad troch de spektrometer, wurdt foar en tidens it eksperimint skjinmakke mei droege filtere loft.Oplossings (500 mg / mL om wetterabsorpsjonspeaks yn 'e spektra te minimalisearjen) waarden pipetteare op' e kristallen, en gels (500 mg / ml) waarden foarme foarôfgeand oan mjitting en dan oerbrocht nei de kristallen (n = 3).1000 scans waarden opnommen mei in resolúsje fan 2 cm-1 en nul duty cycle fan 2. De twadde derivative waard berekkene mei OPUS (Bruker) mei in glêd berik fan njoggen punten.De spektra waarden normalisearre nei deselde yntegraasjeregio tusken 1720 en 1580 cm-1 mei F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Yn ATR-IR spektroskopy is de penetraasjedjipte fan in ynfraread beam yn in stekproef golfnûmer ôfhinklik, wat resulteart yn sterkere absorption by legere golfnûmers as by hegere golfnûmers.Dizze effekten binne net korrizjearre foar de spektra werjûn yn Fig.3 omdat se binne hiel lyts (oanfoljende Fig. 4).Korrigearre spektra foar dizze figuer waarden berekkene mei de Bruker OPUS software.
Yn prinsipe is in wiidweidige kwantifikaasje fan proteïne-konformaasjes mooglik nei betroubere dekonvolúsje fan 'e komponinten binnen de amide I-peak.Dochs ûntsteane guon obstakels yn 'e praktyk.Lûd yn it spektrum kin ferskine as (falske) peaks by dekonvolúsje.Dêrnjonken komt de peak troch wetterbûging oerien mei de posysje fan 'e amide I-peak en kin in ferlykbere grutte hawwe foar samples dy't in grutte hoemannichte wetter befetsje, lykas de wetterige gel dy't hjir studearre is.Dêrom hawwe wy net besocht de amide I-peak folslein te ûntbinen, en ús observaasjes moatte allinich beskôge wurde as stipe fan oare metoaden lykas NMR-spektroskopy.
Oplossingen fan 50 mg / ml NT en His-NT2RepCT waarden oernachtsje by 37 ° C gelearre.De hydrogel waard dan verdund mei 20 mM Tris-HCl (pH 8) oant in konsintraasje fan 12,5 mg / ml, goed skodde en pipetteare om de gel te brekken.Dêrnei waard de hydrogel 10 kear verdund mei 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl fan 'e stekproef waard tapast op in koperen raster bedekt mei formvar, en it oerstallige probleem waard fuortsmiten mei blêdpapier.Samples waarden twa kear wosken mei 5 µl MilliQ wetter en kleurde mei 1% uranylformiaat foar 5 minuten.Fuortsmite oerstallige flekken mei absorberend papier, dan loft droech it gaas.Imaging waard útfierd op dizze rasters mei in FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN operearjend op 100 kV.De ôfbyldings waarden opnommen op x 26.500 en x 43.000 fergruttings mei in Veleta 2k × 2k CCD-kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Dútslân).Foar elke stekproef (n = 1) waarden 10-15 ôfbyldings opnommen.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) waard brûkt foar ôfbyldingsanalyse en mjitting fan fiberdiameters (n = 100, ferskillende fezels).Prisma 9 waard brûkt om unpaired t-tests (twa-tailed) út te fieren.De gemiddelde His-NT2RepCT- en NT-fibrillen wiene respektivelik 11.43 (SD 2.035) en 7.67 (SD 1.389) nm.It betrouwensynterval (95%) is -4.246 oant -3.275.frijheidsgraden = 198, p < 0,0001.
80 µl floeibere samples mei 10 µM thioflavine T (ThT) waarden mjitten yn triplikaat (n = 3) ûnder statyske omstannichheden mei Corning 96-well swarte boaiem dúdlike boaiemplaten (Corning Glass 3881, USA).Fluoreszinsjeferskillen waarden opnommen mei in 440 nm eksitaasjefilter en in 480 nm emisjefilter (FLUOStar Galaxy fan BMG Labtech, Offenburg, Dútslân).It ThT-sinjaal waard noch verzadigd noch quenched, om't eksperiminten mei ferskate konsintraasjes fan ThT waarden útfierd sûnder de sinjaalintensiteit te feroarjen.Record absorbance by 360 nm foar haze mjitting.Foar siedeksperiminten waarden 100 mg / ml gels foarme by 37 ° C., opnij suspendearre en brûkt foar sieden by molêre ferhâldingen fan 5%, 10% en 20%.Gegevens waarden analysearre mei Prism 9.
Thaw foarrieden fan His-NT2RepCT en NT>100 mg/mL op iis en filterje troch in 0.22 µm filter.Konsintraasjes waarden berekkene troch it mjitten fan absorbânsje by 280 nm mei Nanodrop.Yn putten fan in 96-well swarte net-ferbinende plaat (Corning) mei in dúdlike boaiem, waarden samples verdund ta 20 mg / ml yn 20 mM Tris-HCl pH 8 en mingd mei 5 μM ThT (ein konsintraasje), totale sample konsintraasje 50 l folume.Samples waarden elke 10 minuten ôfbylde by 37 ° C op in CellObserver (Zeiss) mikroskoop mei trochstjoerd ljochtkanaal en FITC-eksitaasje- en emisjefiltersets foar ThT-ôfbylding.In 20x/0.4-lens wurdt brûkt foar ôfbylding.Zen Blue (Zeiss) en ImageJ (https://imagej.nih.gov/) waarden brûkt foar ôfbyldingsanalyse.Gels waarden ek taret út NT- en His-NT2RepCT-oplossingen by in konsintraasje fan 50 mg / mL mei 20 mM Tris pH 8 en 5 µM ThT en ynkubeare by 37 ° C foar 90 min.De gelstikken waarden oerbrocht nei in nije put mei 20 mM Tris, pH 8, en 5 μM ThT yn in net-ferbinende swarte 96 goed dúdlike boaiemplaat.Krij griene fluoreszinsje en heldere fjildôfbyldings by 20x / 0.4 fergrutting.ImageJ waard brûkt foar ôfbyldingsanalyse.
Solution NMR spektra waarden krigen by 310 K op in 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometer útrist mei in QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR-monsters dy't 10 mg/mL homogeen proteïne befetsje mei 13C, 15N, oplost yn 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Gemyske ferskowingen fan NT2RepCT by pH 6.7 waarden brûkt om peak 23 yn it 2D-spektrum fan 15N-HSQC te jaan.
Magyske hoeke spinnende fêste NMR (MAS) spektra fan 13C, 15N-labele hydrogels waarden opnommen op in Bruker Avance III HD spektrometer op 800 MHz útrist mei in 3.2 mm 13C / 15N {1H} elektroanleaze sonde.Sample temperatuer waard regele mei help fan in fariabele temperatuer gas stream op 277 K. Twa-diminsjonale dipole rotational resonânsje (DARR) 76 en radio frekwinsje reconnection (RFDR) 77 spectra waarden oankocht op MAS frekwinsjes fan 12,5 kHz en 20 kHz, respektivelik.Krúspolarisaasje (CP) fan 1H oant 13C waard útfierd mei in lineêre oprit fan 60.0 nei 48.0 kHz by 1H, 61.3/71.6 kHz by 13C (by 12.5/20 kHz MAS) en kontakttiid 0.5-1 ms.Spinal6478-ûntkoppeling by 73.5 kHz waard brûkt by gegevenssammeling.De oanwinsttiid wie 10 millisekonden en de syklusfertraging wie 2,5 sekonden.De single-keppele Cα / Cβ-korrelaasjes beoardiele yn 'e RFDR-spektra waarden tawiisd op basis fan' e karakteristike residu-type gemyske ferskowings en multiplisy-keppele korrelaasjes yn 'e DARR-spektra.
De Zipper79-database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) waard brûkt om fluttertendensen en Rosetta-enerzjy te evaluearjen foar NT, NTFlSp, en NTMiSp.De Zipper-databank berekkent Rosetta Energy80, dy't ferskate frije enerzjyfunksjes kombineart om proteïnestruktuer te modellearjen en te analysearjen.In enerzjynivo fan -23 kcal/mol of leger jout in hege oanstriid ta fibrillaasje oan.De legere enerzjy betsjut mear stabiliteit fan 'e twa β-strings yn' e ritskonformaasje.Derneist waard it Waltz-algoritme brûkt om amyloidogenyske regio's te foarsizzen yn NT, NTFlSp en NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
De NT-proteïne-oplossing waard mingd mei 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer by pH 5.5 en 6.0 om de pH te ferleegjen nei respektivelik pH 6 en 7.De definitive proteinkonsintraasje wie 100 mg / ml.
Mjittingen waarden útfierd op in J-1500 CD-spektrometer (JASCO, USA) mei in 300 μL kuvette mei in optysk paad fan 0.1 sm.Proteins waarden verdund nei 10 μM (n = 1) yn 20 mM fosfaatbuffer (pH 8).Om proteinstabiliteit te analysearjen yn 'e oanwêzigens fan sâlt, waarden aaiwiten analysearre op deselde konsintraasje (n = 1) yn 20 mM fosfaatbuffer (pH 8) mei respektivelik 154 mM NaF of NaCl.Temperatuer scans waarden opnommen op 222 nm fan 25 ° C oant 95 ° C mei in ferwaarming taryf fan 1 ° C / min.It oanpart fan natuerlik opfolde aaiwiten waard berekkene mei de formule (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).Dêrnjonken waarden fiif spektra opnommen foar elke stekproef fan 260 nm oant 190 nm by 25 ° C en nei ferwaarming nei 95 ° C.Fiif spektra waarden gemiddeld, glêd en omboud ta molêre elliptisiteit.Gegevens waarden analysearre mei Prism 9.
De fluoreszinsje-yntensiteit fan His-NT-GFP (300 mg / ml, 80 µL) waard mjitten yn triplikaat (n = 3) yn 96-well Corning-platen mei in swarte transparante boaiem (Corning Glass 3881, USA) ûnder statyske omstannichheden.Meitsje samples mei in fluoreszens-basearre plaatlêzer mei in excitaasjegolflingte fan 395 nm en registrearje de emisje op 509 nm foar gelaasje en 2 oeren letter by 37 ° C.Gegevens waarden analysearre mei Prism 9.
Purine nucleoside phosphorylase aktiviteit assay kit (fluorometric metoade, Sigma Aldrich) waard brûkt neffens de fabrikant syn ynstruksjes.Om aktiviteit te mjitten yn gels en oplossingen dy't His-NT-PNP befetsje, mingje 10 ng fan His-NT-PNP mei 100 mg / ml NT oant in totaal folume fan 2 µL, om't de gel in sinjaal joech boppe it deteksje-ynterval fan 'e set.Kontrôles foar gels en oplossingen sûnder His-NT-PNP waarden opnommen.De mjittingen waarden twa kear útfierd (n = 2).Nei't de aktiviteit waard mjitten, waard it reaksjegemik fuortsmiten en de gel fotografearre om te soargjen dat de gel yntakt bleau by de mjitting.Gegevens waarden analysearre mei Prism 9.
Foar mear ynformaasje oer stúdzjeûntwerp, sjoch de Nature study abstract keppele oan dit artikel.
Figuren 1 en 2 jouwe de earste gegevens.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f en 6, Oanfoljende Fig.3, oanfoljende fig.5a, d, oanfoljende fig.6 en oanfoljende fig.8. Gegevens Gegevens fan dizze stúdzje wurde bewarre yn 'e Zenodo-database https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.De NMR-gegevens krigen yn dizze stúdzje waarden pleatst nei it BMRBig-repository ûnder de yngong ID bmrbig36.De struktueren fan GFP en PNP waarden nommen út PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. and Johansson, J. Spinning keunstmjittige spinne.National Chemical.biology.11, 309-315 (2015).
Babb, PL et al.It genoom fan Nephila clavipes markearret it ferskaat oan genen fan spinsiden en har komplekse ekspresje.Nasjonale Genette.49, 895-903 (2017).