Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.
Sliders dy't trije artikels per dia sjen litte.Brûk de efter- en folgjende knoppen om troch de dia's te bewegen, of de slide-controller-knoppen oan 'e ein om troch elke dia te bewegen.

317 RVS coil tubing leveransiers

Gemyske gearstalling tafel fan roestfrij stiel materiaal

SPACA6 is in sperma-útdrukt oerflakprotein dat kritysk is foar gametefúzje by sûchdieren seksuele fuortplanting.Nettsjinsteande dizze fûnemintele rol is de spesifike funksje fan SPACA6 min begrepen.Wy ferklearje de kristalstruktuer fan it ekstrazellulêre domein fan SPACA6 by in resolúsje fan 2.2 Å, ûntbleatet in twa-domeinprotein besteande út in fjouwer-stranded bondel en Ig-like β-sandwiches ferbûn troch quasi-fleksibele linkers.Dizze struktuer liket op IZUMO1, in oar gamete-fúzje-assosjeare proteïne, wêrtroch SPACA6 en IZUMO1 oprjochters binne fan 'e superfamylje fan befruchting-assosjearre aaiwiten dy't hjiryn de IST-superfamylje neamd wurde.De IST-superfamylje wurdt struktureel definieare troch syn twisted fjouwer-helix-bondel en in pear disulfide-keppele CXXC-motiven.In struktuer-basearre AlphaFold-sykjen fan it minsklik proteoom identifisearre ekstra proteïneleden fan dizze superfamylje;notably, in protte fan dizze aaiwiten binne belutsen by gamete fúzje.De SPACA6-struktuer en har relaasje mei oare leden fan 'e IST-superfamylje jouwe de ûntbrekkende keppeling yn ús kennis fan sûchdier-gamete-fúzje.
Elk minskelibben begjint mei twa aparte haploïde gameten: it sperma fan 'e heit en it aai fan 'e mem.Dit sperma is de winner fan in yntinsyf seleksjeproses wêrby't miljoenen sperma-sellen troch it froulike genitalkanaal passe, ferskate obstakels1 oerwinne en kapasitaasje ûndergean, wat har motiliteit en it proses fan oerflakkomponinten ferbettert2,3,4.Sels as it sperma en oöcyt elkoar fine, is it proses noch net foarby.De oocyte wurdt omjûn troch in laach fan cumulus-sellen en in glycoprotein-barriêre neamd de zona pellucida, dêr't sperma troch moat om de oocyte yn te gean.Spermatozoa brûke in kombinaasje fan oerflakadhesionmolekulen en membraan-assosjearre en sekreteare enzymen om dizze lêste barriêres te oerwinnen5.Dizze molekulen en enzymen wurde benammen opslein yn 'e binnenmembraan en akrosomale matrix en wurde ûntdutsen as it bûtenste membraan fan' e sperma wurdt lysed tidens de akrosomale reaksje6.De lêste stap yn dizze yntinsive reis is it sperma-aaifúzjeevenemint, wêrby't de twa sellen har membranen fusearje om ien diploïd organisme te wurden7.Hoewol dit proses baanbrekkend is yn minsklike fuortplanting, wurde de nedige molekulêre ynteraksjes min begrepen.
Neist de befruchting fan gameten is de skiekunde fan 'e fúzje fan twa lipide-bilagen wiidweidich ûndersocht.Yn 't algemien is membraanfúzje in energetysk ûngeunstich proses dat in proteïnekatalysator fereasket om in strukturele konformaasjeferoaring te ûndergean dy't twa membranen tichter byinoar bringt, har kontinuïteit brekke en fúzje feroarsake8,9.Dizze proteïnekatalysatoren steane bekend as fusogens en binne fûn yn ûntelbere fúzjesystemen.Se binne nedich foar virale yngong yn hostsellen (bgl. gp160 yn HIV-1, spike yn coronaviruses, hemagglutinine yn grypfirussen) 10,11,12 placental (syncytin) 13,14,15 en gamete-foarmjende fúzjes yn legere eukaryoten ( HAP2/GCS1 yn planten, protisten en arthropods) 16,17,18,19.Fusogens foar minsklike gameten moatte noch ûntdutsen wurde, hoewol ferskate aaiwiten hawwe bliken dien te wêzen kritysk foar gamete-oanhing en fúzje.De oocyte-útdrukte CD9, in transmembraanprotein nedich foar de fúzje fan mûs- en minsklike gameten, wie de earste dy't ûntdutsen waard 21,22,23.Hoewol syn krekte funksje ûndúdlik bliuwt, liket in rol yn adhesion, de struktuer fan adhesionfoci op aaimikrovilli, en / of de juste lokalisaasje fan oocyte oerflakproteinen wierskynlik 24,25,26.De twa meast typyske aaiwiten dy't kritysk binne foar gametefúzje binne it spermaprotein IZUMO127 en it oocytprotein JUNO28, en har ûnderlinge assosjaasje is in wichtige stap yn gamete-erkenning en adhesion foarôfgeand oan fúzje.Manlike Izumo1-knockout-mûzen en froulike Juno-knockout-mûzen binne folslein sterile, yn dizze modellen komme sperma de perivitelline-romte yn, mar gameten fusearje net.Op deselde manier waard de gearrin fermindere doe't gameten waarden behannele mei anty-IZUMO1 of JUNO27,29 antykladen yn minsklike yn vitro befruchting eksperiminten.
Koartlyn is in nij ûntdutsen groep fan sperma-útdrukte aaiwiten dy't fenotypysk fergelykber binne mei IZUMO1 en JUNO20,30,31,32,33,34,35 ûntdutsen.Sperma acrosomal membraan-assosjearre proteïne 6 (SPACA6) is identifisearre as essensjeel foar befruchting yn in grutskalige murine mutagenese stúdzje.Ynfoegje fan it transgen yn it Spaca6-gen produsearret nonfusible spermatozoa, hoewol dizze spermatozoa's de perivitelline romte 36 ynfiltrearje.Opfolgjende knockoutstúdzjes yn mûzen befêstige dat Spaca6 fereaske is foar gametefúzje 30,32.SPACA6 wurdt hast allinnich yn 'e testes útdrukt en hat in lokalisaasjepatroan fergelykber mei dat fan IZUMO1, nammentlik binnen de intima fan' e spermatozoa foar de akrosomale reaksje, en migreart dan nei de ekwatoriale regio nei de akrosomale reaksje 30,32.Spaca6-homologen besteane yn in ferskaat oan sûchdieren en oare eukaryoten 30 en har belang foar minsklike gametefúzje is oantoand troch ynhibysje fan minsklike befruchting yn vitro troch ferset tsjin SPACA6 30.Oars as IZUMO1 en JUNO bliuwe de details fan 'e struktuer, ynteraksjes en funksje fan SPACA6 ûndúdlik.
Om it fûnemintele proses ûnder de fúzje fan minsklike sperma en aaien better te begripen, wêrtroch't wy takomstige ûntjouwings yn famyljeplanning en fertiliteitsbehanneling kinne ynformearje, hawwe wy SPACA6 strukturele en biogemyske stúdzjes útfierd.De kristalstruktuer fan it ekstrazellulêre domein fan SPACA6 toant in fjouwer-helical bondel (4HB) en in immunoglobulin-like (Ig-like) domein ferbûn troch quasi-fleksibele regio's.Lykas foarsein yn eardere ûndersiken, 7,32,37 is de domeinstruktuer fan SPACA6 fergelykber mei dy fan minsklike IZUMO1, en de twa aaiwiten diele in ûngewoan motyf: 4HB mei in trijehoekich helical oerflak en in pear disulfide-keppele CXXC-motiven.Wy stelle foar dat IZUMO1 en SPACA6 no in gruttere, struktureel relatearre superfamylje fan aaiwiten definiearje dy't ferbûn binne mei gametefúzje.Mei help fan funksjes dy't unyk binne foar de superfamylje, hawwe wy in útputtend sykjen útfierd nei it AlphaFold-strukturele minsklike proteoom, en identifisearje ekstra leden fan dizze superfamylje, ynklusyf ferskate leden belutsen by gametefúzje en / of befruchting.It liket no dat d'r in mienskiplike strukturele fold en superfamylje fan aaiwiten is ferbûn mei gametefúzje, en ús struktuer jout in molekulêre kaart fan dit wichtige aspekt fan it minsklike gametefúzjemeganisme.
SPACA6 is in single-pass transmembrane protein mei ien N-keppele glycan en seis putative disulfide obligaasjes (figueren S1a en S2).Wy ekspresje it ekstrazellulêre domein fan minsklike SPACA6 (residuen 27-246) yn Drosophila S2-sellen en suvere it proteïne mei nikkelaffiniteit, kation-útwikseling, en grutte útslutingchromatografy (Fig. S1b).It suvere SPACA6 ektodomein is heul stabyl en homogeen.Analyse mei help fan grutte útsluting chromatography kombinearre mei polygonal ljocht ferstruit (SEC-MALS) die bliken ien peak mei in berekkene molekulêre gewicht fan 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Dit is yn oerienstimming mei de grutte fan it SPACA6 monomere ektodomein, wat oanjout dat oligomerisaasje net barde tidens suvering.Dêrnjonken iepenbiere sirkulêre dichroïsme (CD) spektroskopy in mingde α / β struktuer mei in smeltpunt fan 51,3 ° C (Fig. S1d, e).Dekonvolúsje fan 'e CD-spektra iepenbiere 38.6% α-helical en 15.8% β-strâne eleminten (figuer S1d).
It SPACA6-ektodomein waard kristallisearre mei willekeurige matrix-sieding38, wat resultearre yn in gegevensset mei in resolúsje fan 2.2 Å (tabel 1 en figuer S3).Mei help fan in kombinaasje fan fragmint-basearre molekulêre substitúsje en SAD phasing gegevens mei bromide bleatstelling foar struktuer bepaling (tabel 1 en figuer S4), it definitive ferfine model bestiet út resten 27-246.Op it stuit dat de struktuer waard bepaald, wiene d'r gjin eksperimintele of AlphaFold-struktueren beskikber.It SPACA6-ektodomein mjit 20 Å × 20 Å × 85 Å, bestiet út sân helices en njoggen β-strings, en hat in langwerpige tertiêre fold stabilisearre troch seis disulfidebindingen (Fig. 1a, b).De swakke elektroanentichtens oan 'e ein fan' e Asn243-sideketen jout oan dat dit residu in N-keppele glycosylaasje is.De struktuer bestiet út twa domeinen: in N-terminal fjouwer-helix bondel (4HB) en in C-terminal Ig-lykas domein mei in tuskenlizzende hinge regio tusken harren (fig. 1c).
in Struktuer fan it ekstrazellulêre domein fan SPACA6.Stripdiagram fan it ekstrazellulêre domein fan SPACA6, de kleur fan 'e keten fan N nei C-terminus fan donkerblau oant donkerread.Cysteines belutsen by disulfide obligaasjes wurde markearre yn magenta.b Topology fan it ekstrazellulêre domein fan SPACA6.Brûk itselde kleurskema as yn figuer 1a.c SPACA6 ekstrazellulêre domein.De 4HB, hinge, en Ig-like domein strip charts binne kleure oranje, grien, en blau, respektivelik.De lagen wurde net op skaal tekene.
It 4HB-domein fan SPACA6 omfettet fjouwer haadhelices (heliksen 1-4), dy't yn 'e foarm fan in spiraalhelix (fig. 2a) arranzjearre binne, ôfwikseljend tusken antiparallel en parallele ynteraksjes (fig. 2b).In lytse ekstra single-turn helix (helix 1′) wurdt loodrecht op 'e bondel lein, en foarmje in trijehoek mei helices 1 en 2. Dizze trijehoek is in bytsje ferfoarme yn' e helical-twisted packing fan 'e relatyf tichte packing fan helices 3 en 4 ( Fig. 2a).
4HB N-terminal strip chart.b Top werjefte fan in bondel fan fjouwer helices, eltse helix markearre yn donkerblau oan de N-terminus en donker read oan de C-terminus.c Top-down spiraal tsjil diagram foar 4HB, mei elk residu werjûn as in sirkel bestimpele mei in single-letter amino acid koade;allinnich de fjouwer aminosoeren oan de top fan it tsjil binne nûmere.Non-polêre resten binne giel kleurd, polar uncharged resten binne kleurd grien, posityf opladen resten binne kleurd blau, en negatyf opladen resten binne kleurd read.d Trijehoekige gesichten fan it 4HB-domein, mei 4HB's yn oranje en hinges yn grien.Beide ynsetten litte staaffoarmige disulfidebindingen sjen.
4HB is konsintrearre op in ynderlike hydrofobe kearn gearstald benammen út alifatyske en aromaatyske resten (Fig. 2c).De kearn befettet in disulfide bân tusken Cys41 en Cys55 dy't ferbynt helices 1 en 2 tegearre yn in boppeste ferhege trijehoek (figuer 2d).Twa ekstra disulfide-obligaasjes waarden foarme tusken it CXXC-motyf yn Helix 1 'en in oar CXXC-motyf fûn oan' e tip fan 'e β-haarpin yn' e hinge regio (fig. 2d).In konservative arginine-residu mei in ûnbekende funksje (Arg37) leit yn in holle trijehoek foarme troch helices 1', 1 en 2. Alifatyske koalstofatomen Cβ, Cγ en Cδ Arg37 ynteraksje mei de hydrofobe kearn, en syn guanidinegroepen bewege syklik. tusken helices 1 'en 1 fia ynteraksjes tusken de Thr32 rêchbonke en kant ketting (fig. S5a, b).Tyr34 wreidet út yn 'e holte en litte twa lytse holtes wêrtroch Arg37 kin ynteraksje mei it solvent.
Ig-like β-sandwich-domeinen binne in grutte superfamylje fan aaiwiten dy't it mienskiplike skaaimerk diele fan twa of mear mearstrengige amfipatyske β-blêden dy't ynteraksje fia in hydrofobe kearn 39. It C-terminale Ig-like domein fan SPACA6 hat itselde patroan en bestiet út twa lagen (fig. S6a).Blêd 1 is in β-blêd fan fjouwer stringen (strings D, F, H, en I) dêr't stringen F, H en I in anty-parallelle arranzjemint foarmje, en stringen I en D in parallelle ynteraksje nimme.Tabel 2 is in lyts anty-parallel dûbele strâne beta sheet (strings E en G).In ynterne disulfide bân waard waarnommen tusken de C-terminus fan de E keten en it sintrum fan de H keten (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Dizze disulfidebân is analoog oan de disulfidebân yn it β-sandwichdomein fan immunoglobulin40,41.
De fjouwer-string β-blêd draait oer de hiele lingte, en foarmje asymmetryske rânen dy't ferskille yn foarm en elektrostatika.De tinner râne is in plat hydrophobic miljeu oerflak dat opfalt yn ferliking mei de oerbleaune oneffen en electrostatically ferskate oerflakken yn SPACA6 (fig. S6b, c).In halo fan bleatsteld rêchbonke carbonyl / amino groepen en polêre kant keatlingen omkrint de hydrophobic oerflak (figuer S6c).De bredere marzje wurdt bedutsen troch in capped helical segmint dat blokkearret de N-terminal diel fan de hydrophobic kearn en foarmet trije wetterstof obligaasjes mei de iepen polar groep fan de F keten rêchbonke (fig. S6d).It C-terminale diel fan dizze râne foarmet in grutte pocket mei in foar in part bleatstelde hydrofobe kearn.De pocket wurdt omjûn troch positive ladingen troch trije sets fan dûbele arginine-residuen (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 en Arg212-Arg214) en in sintrale histidine (His220) (figuer S6e).
It skarniergebiet is in koart segmint tusken it spiraaldomein en it Ig-like domein, besteande út ien antiparallel trije-strâne β-laach (strings A, B en C), in lytse 310 helix, en ferskate lange willekeurige spiraalsegminten.(ôfb. S7).In netwurk fan kovalente en elektrostatyske kontakten yn 'e hinge-regio liket de oriïntaasje te stabilisearjen tusken 4HB en it Ig-like domein.It netwurk kin wurde ferdield yn trije dielen.It earste diel omfettet twa CXXC motiven (27CXXC30 en 139CXXC142) dy't foarmje in pear disulfide obligaasjes tusken de β-haarpin yn it skarnier en de 1' helix yn 4HB.It twadde diel omfettet elektrostatyske ynteraksjes tusken it Ig-like domein en it hinge.Glu132 yn it skarnier foarmet in sâltbrêge mei Arg233 yn it Ig-like domein en Arg135 yn it skarnier.It tredde diel omfettet in kovalente bân tusken it Ig-like domein en de hinge regio.Twa disulfide obligaasjes (Cys124-Cys147 en Cys128-Cys153) ferbine de hinge lus oan in linker dy't wurdt stabilisearre troch elektrostatyske ynteraksjes tusken Gln131 en de rêchbonke funksjonele groep, wêrtroch tagong ta de earste Ig-like domein.ketting.
De struktuer fan it SPACA6-ektodomein en yndividuele struktueren fan 4HB en Ig-like domeinen waarden brûkt om te sykjen nei struktureel ferlykbere records yn proteindatabases 42.Wy identifisearre wedstriden mei hege Dali Z-skoares, lytse standertdeviaasjes, en grutte LALI-skoares (de lêste is it oantal struktureel lykweardige residuen).Wylst de earste 10 hits fan it folsleine ektodomeinsykjen (Tabel S1) in akseptabele Z-score fan>842 hiene, liet in sykopdracht foar 4HB of Ig-like domein allinich sjen dat de measte fan dizze hits allinich oerienkomme mei β-sandwiches.in ubiquitous fold fûn yn in protte aaiwiten.Alle trije sykopdrachten yn Dali levere mar ien resultaat: IZUMO1.
It is al lang suggerearre dat SPACA6 en IZUMO1 strukturele oerienkomsten7,32,37 diele.Hoewol't de ektodomeinen fan dizze twa gamete-fúzje-assosjearre aaiwiten mar 21% sekwinsje-identiteit diele (figuer S8a), makken komplekse bewiis, ynklusyf in bewarre disulfidebânpatroan en in foarsein C-terminal Ig-like domein yn SPACA6, iere besykjen om in te bouwen homologymodel fan A in SPACA6-mûs mei IZUMO1 as sjabloan37.Us struktuer befêstiget dizze foarsizzingen en lit de wiere graad fan oerienkomst sjen.Yn feite diele de SPACA6 en IZUMO137,43,44 struktueren deselde twa-domein arsjitektuer (Fig. S8b) mei ferlykbere 4HB en Ig-like β-sandwich domeinen ferbûn troch in hinge regio (Fig. S8c).
IZUMO1 en SPACA6 4HB hawwe mienskiplike ferskillen fan konvinsjonele spiraalbondels.Typyske 4HBs, lykas dy fûn yn SNARE proteïne kompleksen belutsen by endosomale fúzje 45,46, hawwe evenredige spaasjes helices behâld fan in konstante curvature om in sintrale as 47. Yn tsjinstelling, de helical domeinen yn sawol IZUMO1 en SPACA6 waarden ferfoarme, mei fariabele curvature en oneffen packing (figuer S8d).De twist, wierskynlik feroarsake troch de trijehoeke foarme troch helices 1′, 1 en 2, wurdt bewarre yn IZUMO1 en SPACA6 en stabilisearre troch itselde CXXC-motyf op helix 1′.Lykwols, de ekstra disulfide bân fûn yn SPACA6 (Cys41 en Cys55 covalently keppele helices 1 en 2 hjirboppe) skept in skerpere apex by de trijehoek apex, wêrtroch SPACA6 mear twisted as IZUMO1, mei mear útsprutsen holte trijehoeken.Dêrneist mist IZUMO1 Arg37 waarnommen yn it sintrum fan dizze holte yn SPACA6.Yn tsjinstelling hat IZUMO1 in mear typyske hydrofobe kearn fan alifatyske en aromaatyske resten.
IZUMO1 hat in Ig-lykas domein besteande út in dûbel-strâne en fiif-strâne β-sheet43.De ekstra strân yn IZUMO1 ferfangt de spoel yn SPACA6, dy't ynteraksje mei de F-strân om rêchbonke wetterstofbânen yn 'e strân te beheinen.In nijsgjirrich punt fan ferliking is de foarsein oerflak lading fan de Ig-like domeinen fan de twa aaiwiten.It IZUMO1-oerflak is mear negatyf opladen dan it SPACA6-oerflak.In ekstra lading leit tichtby de C-terminus nei it sperma membraan.Yn SPACA6 wiene deselde regio's mear neutraal of posityf opladen (fig. S8e).Bygelyks, it hydrofobe oerflak (tinere rânen) en posityf opladen pits (bredere rânen) yn SPACA6 binne negatyf opladen yn IZUMO1.
Hoewol't de relaasje en sekundêre struktuer eleminten tusken IZUMO1 en SPACA6 binne goed bewarre bleaun, de strukturele ôfstimming fan de Ig-like domeinen toande dat de twa domeinen ferskille yn harren algemiene oriïntaasje relatyf oan elkoar (Fig. S9).De spiraalbondel fan IZUMO1 is kromme oer de β-sandwich, wêrtroch't de earder beskreaune "boomerang" foarm op sa'n 50 ° fan 'e sintrale as ûntstiet.Yn tsjinstelling, de spiraalfoarmige beam yn SPACA6 waard tilted oer 10 ° yn 'e tsjinoerstelde rjochting.De ferskillen yn dizze oriïntaasjes binne wierskynlik troch ferskillen yn 'e hinge regio.Op it primêre folchoardernivo diele IZUMO1 en SPACA6 in bytsje sekwinsje-oerienkomst by it skarnier, mei útsûndering fan cysteine-, glycine- en asparaginsûrresten.As gefolch, wetterstof obligaasjes en elektrostatyske netwurken binne folslein oars.β-blêd sekundêre struktuer eleminten wurde dield troch IZUMO1 en SPACA6, hoewol't de keatlingen yn IZUMO1 binne folle langer en de 310 helix (helix 5) is unyk foar SPACA6.Dizze ferskillen resultearje yn ferskillende domeinoriïntaasjes foar twa oars ferlykbere aaiwiten.
Us Dali-serversykjen die bliken dat SPACA6 en IZUMO1 de ienige twa eksperiminteel bepaalde struktueren binne opslein yn 'e proteindatabase dy't dizze bepaalde 4HB-fold hawwe (Tabel S1).Mear resint hat DeepMind (Alphabet / Google) AlphaFold ûntwikkele, in neural netwurk basearre systeem dat de 3D-struktueren fan aaiwiten sekuer kin foarsizze út primêre sekwinsjes48.Koart nei't wy de SPACA6-struktuer hawwe oplost, waard de AlphaFold-database frijlitten, dy't foarsizzende struktuermodellen leverje dy't 98.5% fan alle aaiwiten yn it minsklik proteoom bedekke48,49.Mei help fan ús oploste SPACA6-struktuer as sykmodel, identifisearre in struktureel homology-sykjen foar it model yn it AlphaFold-minske proteoom kandidaten mei mooglike strukturele oerienkomsten mei SPACA6 en IZUMO1.Sjoen de ongelooflijke krektens fan AlphaFold yn it foarsizzen fan SPACA6 (Fig. S10a) - benammen it 1.1 Å rms ectodomein yn ferliking mei ús oploste struktuer (Fig. S10b) - kinne wy ​​der wis fan wêze dat de identifisearre SPACA6-oerienkomsten wierskynlik krekt binne.
Earder socht PSI-BLAST nei it IZUMO1-kluster mei trije oare sperma-assosjearre proteïnen: IZUMO2, IZUMO3, en IZUMO450.AlphaFold foarsei dat dizze IZUMO-famyljeproteinen yn it 4HB-domein falle mei itselde disulfidebânpatroan as IZUMO1 (figueren 3a en S11), hoewol se in Ig-like domein misse.It wurdt hypoteze dat IZUMO2 en IZUMO3 iensidige membraanproteinen binne fergelykber mei IZUMO1, wylst IZUMO4 liket te wêzen sekreteare.De funksjes fan IZUMO 2, 3, en 4 aaiwiten yn gamete fúzje binne net bepaald.IZUMO3 is bekend om in rol te spyljen yn acrosome biogenese tidens spermatozoaûntwikkeling51, en it IZUMO-protein foarmet in kompleks50.It behâld fan IZUMO-proteinen yn sûchdieren, reptilen en amfibyen suggerearret dat har potensjele funksje konsistint is mei dy fan oare bekende gamete-fúzje-assosjearre aaiwiten, lykas DCST1/2, SOF1, en FIMP.
Diagram fan 'e domeinarsjitektuer fan' e IST-superfamylje, mei 4HB, hinge, en Ig-like domeinen markearre yn respektivelik oranje, grien en blau.IZUMO4 hat in unike C-terminal regio dy't sjocht swart.Befêstige en putative disulfide-obligaasjes wurde respektivelik werjûn troch fêste en stippele linen.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F15), (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) wurde werjûn yn deselde kleur berik as paniel A. Disulfide obligaasjes wurde werjûn yn magenta.TMEM95, IZUMO2 en IZUMO3 transmembrane helices wurde net werjûn.
Oars as de IZUMO aaiwyt, oare SPACA aaiwiten (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, en SPACA9) wurde tocht te wêzen struktureel oars út SPACA6 (Fig. S12).Allinnich SPACA9 hat 4HB, mar it wurdt net ferwachte dat se deselde parallel-anti-parallelle oriïntaasje as deselde disulfidebân hawwe as SPACA6.Allinich SPACA1 hat in ferlykber Ig-like domein.AlphaFold foarseit dat SPACA3, SPACA4 en SPACA5 in folslein oare struktuer hawwe as SPACA6.Opfallend is dat SPACA4 ek bekend is om in rol te spyljen yn befruchting, mar yn gruttere mjitte dan SPACA6, ynstee fan it fasilitearjen fan de ynteraksje tusken sperma en oocyte zona pellucida52.
Us AlphaFold-sykjen fûn in oare wedstriid foar IZUMO1 en SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, in inkele sperma-spesifike transmembrane proteïne, makket manlike mûzen ûnfruchtber as se ablate 32,33.Spermatozoa dy't TMEM95 ûntbrekke hiene normale morfology, motiliteit en de mooglikheid om de zona pellucida te penetrearjen en te binen oan it aaimembraan, mar koe net fusearje mei it oocyte-membraan.Foarige stúdzjes hawwe sjen litten dat TMEM95 strukturele oerienkomsten dielt mei IZUMO133.Yndied hat it AlphaFold-model befêstige dat TMEM95 in 4HB is mei itselde pear CXXC-motiven as IZUMO1 en SPACA6 en deselde ekstra disulfidebân tusken helices 1 en 2 fûn yn SPACA6 (Fig. 3a en S11).Hoewol TMEM95 in Ig-like domein mist, hat it in regio mei in disulfide-bânpatroan fergelykber mei de SPACA6 en IZUMO1 hinge regio's (fig. 3b).Op it momint fan publikaasje fan dit manuskript rapportearre de preprint-tsjinner de struktuer fan TMEM95, befêstiget it resultaat fan AlphaFold53.TMEM95 is tige ferlykber mei SPACA6 en IZUMO1 en wurdt evolúsjonêr bewarre bleaun yn amfibyen (Fig. 4 en S13).
De PSI-BLAST sykopdracht brûkte de NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, en SOF1 databases om de posysje fan dizze sekwinsjes yn 'e beam fan it libben te bepalen.Ofstannen tusken tûkepunten wurde net op skaal werjûn.
De opfallende algemiene strukturele oerienkomst tusken SPACA6 en IZUMO1 suggerearret dat se stifters binne fan in bewarre strukturele superfamylje dy't de TMEM95 en IZUMO 2, 3, en 4 aaiwiten omfettet.bekende leden: IZUMO1, SPACA6 en TMEM95.Om't mar in pear leden Ig-like domeinen hawwe, is it skaaimerk fan 'e IST-superfamylje it 4HB-domein, dat unike skaaimerken hat dy't mienskiplik binne foar al dizze proteïnen: 1) Coiled 4HB mei helices arranzjearre yn in anty-parallel/parallelle wikseling (Fig. 5a), 2) de bondel hat in trijehoekich gesicht besteande út twa helices binnen de bondel en in tredde fertikale helix (Fig. kaaigebiet (Fig. 5c). It CXXC-motyf, fûn yn thioredoxine-like aaiwiten, is bekend om te funksjonearjen as in redox sensor 54,55,56, wylst it motyf yn IST famyljeleden kin wurde assosjearre mei protein disulfide isomerases lykas ERp57 yn gamete fúzje.Rollen wurde assosjearre 57,58.
Leden fan de IST superfamily wurde definiearre troch trije karakteristike skaaimerken fan de 4HB domein: fjouwer helices ôfwikseljend tusken parallel en antiparallel oriïntaasje, ba-trijehoekige helical bondel gesichten, en in ca CXXC dûbele motyf foarme tusken lytse molekulen.) N-terminale helixes (oranje) en hinge regio β-haarpin (grien).
Sjoen de oerienkomst tusken SPACA6 en IZUMO1, waard it fermogen fan 'e eardere om te binen oan IZUMO1 of JUNO hifke.Biolayer interferometry (BLI) is in kinetysk-basearre binende metoade dy't earder is brûkt om de ynteraksje tusken IZUMO1 en JUNO te kwantifisearjen.Nei ynkubaasje fan 'e biotin-labele sensor mei IZUMO1 as in aas mei in hege konsintraasje fan JUNO-analyt, waard in sterk sinjaal ûntdutsen (Fig. S14a), wat oanjout op in bining-induzearre feroaring yn' e dikte fan it biomateriaal oan 'e sensor tip.Similar sinjalen (ie, JUNO keppele oan de sensor as in aas tsjin IZUMO1 analyte) (fig. S14b).Gjin sinjaal waard ûntdutsen doe't SPACA6 waard brûkt as in analyt tsjin sensor-bound IZUMO1 of sensor-bound JUNO (Figure S14a, b).It ûntbrekken fan dit sinjaal jout oan dat it ekstrazellulêre domein fan SPACA6 net ynteraksje mei it ekstrazellulêre domein fan IZUMO1 of JUNO.
Om't de BLI-assay is basearre op biotinylaasje fan frije lysine-residuen op it aasprotein, kin dizze modifikaasje binding foarkomme as lysine-residuen belutsen binne by de ynteraksje.Dêrnjonken kin de oriïntaasje fan 'e bining relatyf oan' e sensor steryske hinderingen meitsje, sadat konvinsjonele pull-down-assays ek útfierd waarden op 'e rekombinante SPACA6, IZUMO1 en JUNO ektodomeinen.Nettsjinsteande dit, SPACA6 net precipitate mei His-tagged IZUMO1 of His-tagged JUNO (Fig. S14c, d), wat oanjout gjin ynteraksje yn oerienstimming mei dat waarnommen yn BLI eksperiminten.As in positive kontrôle befêstige wy de ynteraksje fan JUNO mei markearre His IZUMO1 (figueren S14e en S15).
Nettsjinsteande de strukturele oerienkomst tusken SPACA6 en IZUMO1, is it ûnfermogen fan SPACA6 om JUNO te binen net ferrassend.It oerflak fan minsklike IZUMO1 hat mear as 20 resten dy't ynteraksje mei JUNO, ynklusyf resten út elk fan de trije regio (hoewol't de measten fan harren lizze yn de hinge regio) (Fig. S14f).Fan dizze resten is mar ien bewarre yn SPACA6 (Glu70).Wylst in protte restsubstitúsjes har oarspronklike biogemyske eigenskippen behâlden, waard it essensjele Arg160-residu yn IZUMO1 ferfongen troch de negatyf opladen Asp148 yn SPACA6;eardere stúdzjes hawwe sjen litten dat de Arg160Glu mutaasje yn IZUMO1 hast folslein ôfskaft bining oan JUNO43.Dêrnjonken fergrutte it ferskil yn domeinoriïntaasje tusken IZUMO1 en SPACA6 it oerflak fan 'e JUNO-binende side fan' e lykweardige regio op SPACA6 signifikant (fig. S14g).
Nettsjinsteande it bekende ferlet fan SPACA6 foar gametefúzje en syn oerienkomst mei IZUMO1, liket SPACA6 gjin lykweardige JUNO-binende funksje te hawwen.Dêrom hawwe wy socht om ús strukturele gegevens te kombinearjen mei bewiis fan belang levere troch evolúsjonêre biology.Sequence-ôfstimming fan SPACA6-homologen toant it behâld fan 'e mienskiplike struktuer bûten sûchdieren.Bygelyks, cysteine-residuen binne oanwêzich sels yn fier besibbe amfibyen (fig. 6a).Mei help fan de ConSurf-tsjinner, waarden behâldgegevens foar meardere folchoarderôfstimming fan 66-sekwinsjes yn kaart brocht oan it SPACA6-oerflak.Dit soarte fan analyze kin sjen litte hokker resten binne bewarre bleaun tidens proteïne evolúsje en kin oanjaan hokker oerflak regio spylje in rol yn funksje.
in Sequence-ôfstimming fan SPACA6-ektodomeinen fan 12 ferskillende soarten taret mei CLUSTAL OMEGA.Neffens de ConSurf-analyse binne de meast konservative posysjes yn blau markearre.Cysteine-residuen wurde yn read markearre.Domeingrinzen en sekundêre struktuer-eleminten wurde oan 'e boppekant fan' e ôfstimming werjûn, wêrby't pylken β-strânen oanjaan en weagen helices oanjaan.De NCBI Access Identifiers dy't de sekwinsjes befetsje binne: minske (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin aap (Cebus mimic, XP_017359366), hynder (Equus caballus5 killer, XP6_02ca (XP31023 killer, XP61023) 032_034).), skiep (Ovis aries, XP_014955560), oaljefant (Loxodonta africana, XP_010585293), hûn (Canis lupus familyis, XP_025277208), mûs (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil, XPi3_1, Tasmanian devil, XPi3_1, XP331, Tasmanian devil, XP31 ), Platypus, 8) , 61_89 en Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).De nûmering is basearre op minsklike oarder.b Surface fertsjintwurdiging fan de SPACA6 struktuer mei 4HB oan de top en Ig-lykas domein oan de ûnderkant, kleuren basearre op behâld skattings út de ConSurf tsjinner.De bêst bewarre dielen binne yn blau, de matig bewarre dielen binne yn wyt, en de minst bewarre binne yn giel.pearse cysteine.Trije oerflakpatches dy't in heech nivo fan beskerming demonstrearje, wurde werjûn yn 'e ynset labele patches 1, 2 en 3. In 4HB-cartoon wurdt werjûn yn' e ynset rjochtsboppe (itselde kleurskema).
De SPACA6-struktuer hat trije tige bewarre oerflakregio's (fig. 6b).Patch 1 oerspant 4HB en de hinge regio en befettet twa bewarre CXXC disulfide brêgen, in Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 hinge netwurk (Fig. S7), en trije bewarre bûtenste aromaatyske resten (Phe31, Tyr73, Phe137)).in bredere râne fan it Ig-like domein (fig. S6e), dy't ferskate posityf opladen resten op it sperma-oerflak foarstelt.Ynteressant befettet dizze patch in antykodytoop dat earder is oantoand dat it ynterfereart mei SPACA6 30-funksje.Regio 3 spant it hinge en de iene kant fan it Ig-like domein;dizze regio befettet bewarre prolines (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) en nei bûten rjochte polar / opladen resten.Ferrassend binne de measte oerbliuwsels op it oerflak fan 4HB tige fariabele (Fig. 6b), hoewol de fold yn 'e SPACA6-homolooch bewarre wurdt (lykas oanjûn troch it konservatisme fan' e hydrofobe bondelkearn) en bûten de IST-superfamylje.
Hoewol't dit de lytste regio yn SPACA6 is mei de minste detectable sekundêre struktuer eleminten, in protte hinge regio oerbliuwsels (ynklusyf regio 3) binne tige konservearre ûnder SPACA6 homologues, dat kin oanjaan dat de oriïntaasje fan de helical bondel en β-sandwich spilet in rol.as konservatyf.Lykwols, nettsjinsteande wiidweidige wetterstof bonding en elektrostatyske netwurken yn de hinge regio fan SPACA6 en IZUMO1, bewiis fan yntrinsike fleksibiliteit kin sjoen wurde yn de ôfstimming fan de meardere tastiene struktueren fan IZUMO137,43,44.De ôfstimming fan 'e yndividuele domeinen oerlappe goed, mar de oriïntaasje fan' e domeinen relatyf oan elkoar farieare fan 50 ° oant 70 ° fan 'e sintrale as (fig. S16).Om de konformaasjedynamyk fan SPACA6 yn oplossing te begripen, waarden SAXS-eksperiminten útfierd (Fig. S17a, b).Ab initio rekonstruksje fan de SPACA6 ektodomein conformed oan in rod crystal struktuer (Fig. S18), hoewol't de Kratky plot toande wat graad fan fleksibiliteit (Fig. S17b).Dizze konformaasje stiet yn kontrast mei IZUMO1, wêrby't it ûnbûne proteïne in boomerangfoarm oannimt sawol yn it rooster as yn oplossing43.
Om spesifyk de fleksibele regio te identifisearjen, waard wetterstof-deuterium-útwikselmassaspektroskopy (H-DXMS) útfierd op SPACA6 en fergelike mei gegevens dy't earder krigen op IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 is dúdlik fleksibeler as IZUMO1, lykas oanjûn troch in hegere deuterium-útwikseling yn 'e struktuer nei 100.000 s fan útwikseling.Yn beide struktueren toant it C-terminale diel fan 'e hinge-regio in heech nivo fan útwikseling, wat wierskynlik beheinde rotaasje fan 4HB- en Ig-like domeinen relatyf oan elkoar mooglik makket.Ynteressant is it C-terminale diel fan 'e SPACA6-skarnier, besteande út it 147CDLPLDCP154-residu, in tige bewarre regio 3 (Fig. 6b), mooglik oanjout dat ynterdomeinfleksibiliteit in evolúsjonêr bewarre funksje fan SPACA6 is.Neffens de fleksibiliteit analyze, CD termyske melt gegevens toande dat SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) is minder stabyl as IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) (Fig. S1e en S19).
in H-DXMS bylden fan SPACA6 en b IZUMO1.It persintaazje deuterium-útwikseling waard bepaald op 'e oantsjutte tiidpunten.Nivo's fan wetterstof-deuterium-útwikseling wurde oanjûn troch kleur op in gradientskaal fan blau (10%) oant read (90%).Swarte doazen fertsjintwurdigje gebieten fan hege útwikseling.De grinzen fan 4HB, hinge en Ig-like domein beoardiele yn 'e kristalstruktuer wurde boppe de primêre folchoarder werjûn.Deuterium-útwikselingsnivo's op 10 s, 1000 s, en 100.000 s waarden útset op in stripkaart boppe op 'e transparante molekulêre oerflakken fan SPACA6 en IZUMO1.Dielen fan struktueren mei in deuterium-útwikselingsnivo ûnder 50% binne wyt kleurd.Gebieten boppe 50% H-DXMS útwikseling binne kleurd yn in gradient skaal.
It gebrûk fan CRISPR/Cas9 en mûsgen-knockout-genetyske strategyen hat laat ta de identifikaasje fan ferskate faktoaren dy't wichtich binne foar sperma- en aai-bining en fúzje.Utsein de goed karakterisearre ynteraksje fan IZUMO1-JUNO en CD9-struktuer, bliuwe de measte aaiwiten ferbûn mei gametefúzje struktureel en funksjoneel enigmatysk.De biofysyske en strukturele karakterisearring fan SPACA6 is in oar stik fan 'e adhesion / fúzje molekulêre puzel by befruchting.
SPACA6 en oare leden fan de IST superfamily lykje te wêzen tige bewarre yn sûchdieren likegoed as yndividuele fûgels, reptilen, en amfibyen;yn feite wurdt tocht dat SPACA6 sels nedich is foar befruchting yn sebrafisk 59. Dizze ferdieling is fergelykber mei oare bekende gamete-fúzje-assosjearre aaiwiten lykas DCST134, DCST234, FIMP31 en SOF132, wat suggerearret dat dizze faktoaren HAP2-deficient binne (ek bekend as GCS1) proteïnen dy't ferantwurdlik binne foar de katalytyske aktiviteit fan in protte protisten., planten en geleedpotigen.Fertilisearre fúzjeproteinen 60, 61. Nettsjinsteande de sterke strukturele oerienkomst tusken SPACA6 en IZUMO1, knockout fan genen dy't ien fan dizze aaiwiten kodearje, resultearre yn ûnfruchtberens yn manlike mûzen, wat oanjout dat har funksjes yn gametefúzje net duplikearre binne..Mear breed is gjin fan 'e bekende spermaproteinen dy't nedich binne foar de adhesionfaze fan fúzje oerstallich.
It bliuwt in iepen fraach oft SPACA6 (en oare leden fan 'e IST-superfamylje) dielnimme oan yntergametyske knooppunten, yntragametyske netwurken foarmje om wichtige aaiwiten te rekrutearjen nei fúzjepunten, of miskien sels as ûnbidige fusogens fungearje.Co-immunoprecipitaasjestúdzjes yn HEK293T-sellen lieten in ynteraksje sjen tusken IZUMO1 en SPACA632 mei folsleine lingte.Us rekombinante ektodomeinen hawwe lykwols gjin ynteraksje yn vitro, wat suggerearret dat de ynteraksjes sjoen yn Noda et al.waarden beide wiske yn it konstruksje (note de cytoplasmyske sturt fan IZUMO1, dy't oantoand is net nedich te wêzen foar befruchting62).As alternatyf kinne IZUMO1 en / of SPACA6 spesifike binende omjouwings fereaskje dy't wy net yn vitro reprodusearje, lykas fysiologysk spesifike konformaasjes of molekulêre kompleksen mei oare aaiwiten (bekend as noch net ûntdutsen).Hoewol it IZUMO1-ektodomein wurdt leaud om befestiging fan spermatozoa oan it aai yn 'e perivitelline-romte te bemiddeljen, is it doel fan it SPACA6-ektodomein ûndúdlik.
De struktuer fan SPACA6 ûntbleatet ferskate bewarre oerflakken dy't belutsen kinne wêze by proteïne-protein-ynteraksjes.It bewarre diel fan 'e hinge-regio direkt neist it CXXC-motyf (oanwiisd Patch 1 hjirboppe) hat ferskate nei bûten rjochte aromaatyske residuen dy't faak ferbûn binne mei hydrofobe en π-stapeljende ynteraksjes tusken biomolekulen.De brede kanten fan it Ig-like domein (regio 2) foarmje in posityf opladen groove mei tige konservearre Arg en His resten, en antykladen tsjin dizze regio binne earder brûkt om gametefúzje 30 te blokkearjen.It antykodym herkent de lineêre epitoop 212RIRPAQLTHRGTFS225, dy't trije fan 'e seis arginine-residuen hat en heech bewarre His220.It is net dúdlik oft de dysfunksje komt troch blokkearjen fan dizze spesifike resten of de hiele regio.De lokaasje fan dit gat tichtby de C-terminus fan 'e β-sandwich jout cis-ynteraksjes oan mei oanbuorjende spermaproteinen, mar net mei oocyteproteinen.Fierder kin it behâld fan in heul fleksibele proline-rike tangle (side 3) binnen it skarnier de side wêze fan in proteïne-protein-ynteraksje of, wierskynliker, it behâld fan fleksibiliteit tusken de twa domeinen oanjaan.Geslacht is wichtich foar de ûnbekende rol fan SPACA6.fúzje fan gameten.
SPACA6 hat eigenskippen fan intercellular adhesion aaiwiten, ynklusyf Ig-like β-sandwiches.In protte adhesive aaiwiten (bygelyks, cadherins, integrins, adhesins, en IZUMO1) besitte ien of mear β-sandwich domeinen dy't útwreidzje aaiwiten út de sel membraan nei harren miljeu doelen63,64,65.It Ig-like domein fan SPACA6 befettet ek in motyf dat faaks fûn wurdt yn β-sandwiches fan adhesion en gearhing: dûbeltsjes fan parallelle stringen oan 'e úteinen fan β-sandwiches, bekend as meganyske clamps66.It wurdt leaud dat dit motyf ferset fergruttet tsjin skuorkrêften, wat weardefol is foar aaiwiten belutsen by ynterzellulêre ynteraksjes.Nettsjinsteande dizze oerienkomst mei adhesins, is der op it stuit gjin bewiis dat SPACA6 ynteraksje mei aaiwyt.It SPACA6-ektodomein is net yn steat om te binen oan JUNO, en SPACA6-ekspresje HEK293T-sellen, lykas hjir te sjen, amper ynteraksje mei oocytes dy't zona 32 ûntbrekke.As SPACA6 yntergametyske obligaasjes fêststelle, kinne dizze ynteraksjes post-translasjonele modifikaasjes of stabilisaasje fereaskje troch oare spermaproteinen.Yn stipe fan 'e lêste hypoteze bine IZUMO1-deficient spermatozoa oan oocytes, oantoand dat oare molekulen as IZUMO1 belutsen binne by de gamete adhesion stap 27.
In protte virale, sellulêre en ûntwikkelingsfúzjeproteinen hawwe eigenskippen dy't har funksje as fusogens foarsizze.Bygelyks, virale fúzje glycoproteins (klassen I, II en III) hawwe in hydrofoob fúzje peptide of loop oan 'e ein fan it aaiwyt dat wurdt ynfoege yn de host membraan.De hydrofilisiteitskaart fan IZUMO143 en de struktuer (bepaald en foarsein) fan 'e IST-superfamylje lieten gjin skynbere hydrofobe fúzjepeptide sjen.Dus, as aaiwiten yn 'e IST-superfamylje as fusogens funksjonearje, dogge se dat op in manier oars as oare bekende foarbylden.
Ta beslút bliuwe de funksjes fan 'e leden fan' e IST-superfamylje fan proteïnen dy't ferbûn binne mei gamete-fúzje in tintalisearjend mystearje.Us karakterisearre SPACA6-rekombinante molekule en har oploste struktuer sille ynsjoch jaan yn 'e relaasjes tusken dizze dielde struktueren en har rol yn gamete-oanhing en fúzje.
De DNA-sekwinsje dy't oerienkomt mei it foarsein minsklike SPACA6-ektodomein (NCBI-tagongsnûmer NP_001303901.1; residuen 27-246) waard codon-optimisearre foar ekspresje yn Drosophila melanogaster S2-sellen en synthesisearre as in genfragmint mei de folchoarder Kozak (Eurofins Genomics)., it BiP-sekresje-sinjaal en de korrespondearjende 5'- en 3'-einen foar ligaasje-ûnôfhinklike klonen fan dit gen yn in pMT-ekspresjevektor basearre op in metallothionein-promotor oanpast foar seleksje mei puromycin (pMT-puro).De pMT-puro-fektor kodearret in trombine-splitsingsside folge troch in 10x-His C-terminal tag (figuer S2).
Stabile transfeksje fan de SPACA6 pMT-puro vector yn D. melanogaster S2 (Gibco) sellen waard útfierd fergelykber mei it protokol brûkt foar IZUMO1 en JUNO43.S2-sellen waarden ûntdutsen en groeid yn Schneider's medium (Gibco) oanfolle mei in definitive konsintraasje fan 10% (v / v) waarmte-ynaktivearre fetale kalfserum (Gibco) en 1X antimykotyske antibiotika (Gibco).Early passaazje sellen (3.0 x 106 sellen) waarden plated yn yndividuele boarnen fan 6-well platen (Corning).Nei 24 oeren fan ynkubaasje by 27 ° C, sellen waarden transfected mei in mingsel fan 2 mg fan de SPACA6 pMT-puro vector en Effectene transfection reagens (Qiagen) neffens it protokol fan de fabrikant.Transfekteare sellen waarden 72 oeren ynkubeare en dan rispe mei 6 mg / ml puromycin.Sellen waarden doe isolearre fan folslein Schneider's medium en pleatst yn serumfrije Insect-XPRESS-medium (Lonza) foar grutskalige proteinproduksje.In 1 L-batch fan S2-selkultuer waard groeid ta 8-10 × 106 ml-1-sellen yn in 2 L-ventileare flat-bottomed polypropylene Erlenmeyer-kolf en dêrnei sterilisearre mei in definitive konsintraasje fan 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) en sterilisearre.induced.De induced kultueren waarden incubated by 27 ° C. at 120 rpm foar fjouwer dagen.
Betingst medium mei SPACA6 waard isolearre troch sintrifugering by 5660 × g by 4 ° C folge troch in Centramate tangential flow filtration systeem (Pall Corp) mei in 10 kDa MWCO membraan.Tapasse konsintrearre medium mei SPACA6 op in 2 ml Ni-NTA agarose hars (Qiagen) kolom.De Ni-NTA-hars waard wosken mei 10 kolomvoluminten (CV) fan buffer A en dan waard 1 CV fan buffer A tafoege om in definitive imidazolkonsintraasje fan 50 mM te jaan.SPACA6 waard eluearre mei 10 ml buffer A oanfolle mei imidazole oant in definitive konsintraasje fan 500 mM.Beheiningsklasse trombine (Millipore Sigma) waard direkt tafoege oan de dialysebuis (MWCO 12-14 kDa) by 1 ienheid per mg SPACA6 tsjin 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 en 150 mM NaCl (buffer B) foar dialyse.) op 4 ° C foar 48 oeren.De thrombin-splitste SPACA6 waard dan trije kear verdund om sâltkonsintraasje te ferleegjen en laden op in 1 ml MonoS 5/50 GL kation-útwikselkolom (Cytiva / GE) lykwichtich mei 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.De kation-útwikseler waard wosken mei 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, dan waard SPACA6 eluearre mei in lineêre gradient fan 0 oant 500 mm NaCl yn 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 foar 25 OK.Nei ion útwikseling chromatography waard SPACA6 konsintrearre oan 1 ml en eluted isocratically út in ENrich SEC650 10 x 300 kolom (BioRad) equilibrated mei buffer B. Neffens de chromatogram, pool en konsintrearje fraksjes befetsjende SPACA6.Reinheid waard kontrolearre troch Coomassie-bekleurde elektroforese op in 16% SDS-polyacrylamide gel.Proteinkonsintraasje waard kwantifisearre troch absorption by 280 nm mei de Beer-Lambert-wet en de teoretyske molêre útstjerrenkoëffisjint.
Purified SPACA6 waard oernachtich dialysearre tsjin 10 mM natriumfosfaat, pH 7.4 en 150 mM NaF en verdund nei 0.16 mg / ml foarôfgeand oan analyze troch CD-spektroskopie.Spektrale skennen fan CD's mei in golflingte fan 185 oant 260 nm waard sammele op in Jasco J-1500 spektropolarimeter mei help fan kwartskuvetten mei in 1 mm optyske paadlange (Helma) by 25 ° C mei in snelheid fan 50 nm / min.De CD-spektra waarden baseline korrizjearre, gemiddeld oer 10 oanwinsten, en omboud ta gemiddelde residuele elliptisiteit (θMRE) yn graden cm2 / dmol:
dêr't MW is it molekulêre gewicht fan elk stekproef yn Da;N is it oantal aminosoeren;θ is de elliptisiteit yn milligraden;d komt oerien mei de lingte fan it optyske paad yn cm;protein konsintraasje yn ienheden.