347 12.7 * 1.24mm RVS coiled buizen, Molekulêre meganisme fan syngroane elektrostatyske kondensaasje en koaggregaasje fan α-synuclein en tau

Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.
Sliders dy't trije artikels per dia sjen litte.Brûk de efter- en folgjende knoppen om troch de dia's te bewegen, of de slide-controller-knoppen oan 'e ein om troch elke dia te bewegen.

347 Stainless Steel Pipe Specification

347 12.7 * 1.24mm RVS coiled buizen

Bûtendiameter: 6.00 mm OD oant 914.4 mm OD, Maten oant 24” NB beskikber Ex-stock, OD Grutte Stalen buizen beskikber Ex-stock

SS 347 Pipe Dikte berik: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ensfh. (0.5-12mm) Of net-reguliere grutte wurde oanpast as nedich

Type: SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW Pipes |SS 347 Welded Pipes |SS 347 Fabricated Pipes |SS 347 CDW buizen, LSAW buizen / naad laske / opnij tekene

Foarm: SS 347 Rûne Pipes / Tubes, SS 347 Square Pipes / Tubes, SS 347 Rjochthoekige Pipe / Tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 "U" foarm, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

Lingte: ien willekeurich, dûbel willekeurich en fereaske lingte ein: gewoan ein, skuorre ein, treade

End Protection: Plastic Caps |Bûtenfinish: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Finish foar RVS buizen, Finish as per klant Requirements

Leveringsbetingsten: annealed en ingelegde, gepolijst, helder annealed, kâld tekene

Ynspeksje, testrapporten: mûne testsertifikaten, EN 10204 3.1, gemyske rapporten, meganyske rapporten, PMI-testrapporten, fisuele ynspeksjerapporten, ynspeksjerapporten fan tredden, NABL-goedkard laboratoariumrapporten, destruktyf testrapport, net-destruktive testrapporten

Ferpakking: ynpakt yn houten doazen, plestik tassen, stielen strips bondele, of neffens oanfragen fan klanten

Specials: Grutte en spesifikaasjes oars as boppesteande kinne wurde produsearre op oanfraach

SS 347 Pipe Grutte berik: 1/2 inch NB, OD oant 24 inch

ASTM A312 347: Naadleaze en rjochte naad laske austenityske piip bedoeld foar hege temperatuer en algemiene korrosive tsjinst.Filler metaal net tastien tidens welding.

ASTM A358 347: Elektryske fúzje laske austenityske piip foar korrosive en / as tsjinst op hege temperatuer.Typysk wurdt allinich pipe oant 8 inch produsearre neffens dizze spesifikaasje.Tafoeging fan fillermetaal is tastien tidens welding.

ASTM A790 347: Naadleaze en rjochte naad laske ferrityske / austenityske (dupleks) piip bedoeld foar algemiene korrosive tsjinst, mei in bysûndere klam op wjerstân tsjin spanningskorrosje-barsten.

ASTM A409 347: Straight-seam as spiraal-seam elektryske fúzje laske austenityske ljochtmuorrepipe mei grutte diameter yn maten 14" oant 30" mei muorren Sch5S en Sch 10S foar korrosive en / of hege

ASTM A376 347: Naadleaze austenityske piip foar hege temperatuerapplikaasjes.

ASTM A813 347: Austenityske piip mei ien naad, ien of dûbel laske foar hege temperatuer en algemiene korrosive tapassingen.

ASTM A814 347: Kâld bewurke laske austenityske piip foar hege temperatuer en algemiene korrosive tsjinst.

347H Stainless Steel Pipes gemyske gearstalling

Stainless Steel 347H Pipe meganyske eigenskippen

Stainless Steel 347H Pipes Fysike eigenskippen

Equivalent Grades foar 347H RVS Pipe

Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregation is in skaaimerk fan 'e sykte fan Parkinson en oare synucleinopathyen.Koartlyn is it tau-proteïne gewoanlik assosjearre mei de sykte fan Alzheimer assosjeare mei αS-patology en fûn te co-lokalisearjen yn αS-rike ynklúzjes, hoewol it molekulêre meganisme fan koaggregaasje fan 'e twa aaiwiten ûndúdlik bliuwt.Wy rapportearje hjir dat de αS-faze skiedt yn floeibere kondensaten fia elektrostatyske komplekse kondensaasje mei posityf opladen polypeptiden lykas tau.Ofhinklik fan 'e affiniteit fan αS foar polykations en de taryf fan valence-útputting fan it koagulaasjenetwurk, ûndergeane klots rappe gelaasje of koalesinsje folge troch stadige amyloïdeaggregaasje.Troch it kombinearjen fan in suite fan avansearre biophysical techniken, wy wienen by steat om te karakterisearjen de floeistof-floeibere αS / Tau faze skieding en identifisearje de kaai faktoaren dy't liede ta de foarming fan heterogene aggregaten befetsje beide aaiwiten yn in floeibere protein condensate.
Neist membraanfakken kin romtlike skieding yn sellen ek berikt wurde troch de formaasje fan proteïnerike, floeibere tichte lichems neamd biomolekulêre kondensaten of druppels, troch in proses bekend as floeistof-floeistof faze skieding (LLPS).Dizze druppels wurde foarme troch multivalente tydlike ynteraksjes, meastentiids tusken aaiwiten of aaiwiten en RNA, en tsjinje in ferskaat oan funksjes yn hast alle libbene systemen.In grut oantal LLP-kapabele aaiwiten eksposearje sekwinsjes fan lege kompleksiteit dy't tige ûnregelmjittich binne yn 'e natuer en yn' e foarming fan biomolekulêre kondensaten3,4,5.Tal fan eksperimintele ûndersiken hawwe de fleksibele, faak ûnregelmjittige en multyvalente aard fan 'e aaiwiten iepenbiere dy't dizze flüssige kondensaten foarmje, hoewol't der net folle bekend is oer de spesifike molekulêre determinanten dy't de groei en rypjen fan dizze kondensaten kontrolearje nei in mear solide-like steat..
De nije gegevens stypje de hypoteze dat ôfwikende proteïne-oandreaune LLPS en transformaasje fan druppels yn fêste struktueren relevante sellulêre paden kinne wêze dy't liede ta de formaasje fan ûnoplosbere giftige aggregaten dy't faaks skaaimerken binne fan degenerative sykten.In protte LLPS-assosjearre yntrinsysk steurde proteïnen (IDP's), faak heech opladen en fleksibel, binne lang ferbûn mei neurodegeneraasje troch it proses fan amyloïde aggregaasje.Benammen biomolekulêre IDP-kondensaten lykas FUS7 of TDP-438 of proteïnen mei grutte domeinen mei lege kompleksiteit lykas hnRNPA19 hawwe bliken dien te leeftyd yn gel-like of sels fêste foarmen troch in proses neamd fluidisaasje.gearstalde.nei fêste faze-oergong (LSPT) as funksje fan tiid of yn reaksje op bepaalde post-translasjonele modifikaasjes of patologysk signifikante mutaasjes1,7.
In oare IDP assosjearre mei LLPS in vivo is Tau, in mikrotubule-assosjearre steurd proteïne waans amyloïde aggregaasje is belutsen by de sykte fan Alzheimer10, mar is ek koartlyn belutsen by de sykte fan Parkinson (PD) en oare synaptyske nukleêre proteinopathies 11, 12, 13 binne besibbe.Tau is oantoand spontaan dissociate út oplossing / cytoplasma fanwege geunstige elektrostatyske ynteraksjes14, resultearret yn de formaasje fan tau-ferrike druppels bekend as elektrostatyske coacervates.It is ek waarnommen dat dit soarte fan net-spesifike ynteraksje de driuwende krêft is efter in protte biomolekulêre kondensaten yn 'e natuer15.Yn it gefal fan in tau-proteïne kin elektrostatyske aggregaasje foarme wurde troch ienfâldige aggregaasje, wêrby't tsjinoer laden regio's fan it proteïne it spjaltingsproses triggerje, of troch komplekse aggregaasje troch ynteraksje mei negatyf laden polymeren lykas RNA.
Koartlyn is α-synuclein (αS), in amyloïde IDP belutsen by PD en oare neurodegenerative sykten kollektyf bekend as synucleinopathy17,18, is oantoand yn sellulêre en diermodellen19,20 konsintrearre yn proteïnekondensaten mei fluid-like gedrach.In vitro-stúdzjes hawwe oantoand dat αS LLPS ûndergiet troch ienfâldige aggregaasje troch foaral hydrofobe ynteraksjes, hoewol dit proses útsûnderlik hege proteinkonsintraasjes en atypysk lange ynkubaasjetiden fereasket19,21.Oft de αS-befette kondensaten dy't yn vivo waarnommen wurde wurde foarme troch dizze of oare LLPS-prosessen, bliuwt in wichtich ûnoplost probleem.Lykas, hoewol αS-amyloïde-aggregaasje is waarnommen yn neuroanen yn PD en oare synucleinopathies, bliuwt it krekte meganisme wêrmei't αS intrazellulêre amyloïde-aggregaasje ûndergiet ûndúdlik, om't oerekspresje fan dit proteïne dit proses sels net liket te triggerjen.Oanfoljende sellulêre skea is faaks fereaske, wat suggerearret dat bepaalde sellulêre lokaasjes of mikroomjouwings nedich binne foar it werneamen fan intrazellulêre αS-amyloïde-assemblies.Ien sellulêre omjouwing dy't benammen gefoelich is foar aggregaasje kin it ynterieur fan proteinkondensaten 23 wêze.
Nijsgjirrich binne fûn dat αS en tau ko-lokalisearje yn karakteristike sykte-ynklúzjes yn minsken mei de sykte fan Parkinson en oare synucleinopathies 24,25 en eksperiminten hawwe in synergistyske patologyske relaasje rapportearre tusken de twa aaiwiten 26,27, wat suggerearret in potinsjele relaasje tusken aggregation αS en tau yn neurodegenerative sykten.sykte.αS en tau binne fûn om elkoars aggregaasje yn vitro en in vivo 28,29 te ynteraksje en te befoarderjen en heterogene aggregaten dy't út dizze twa aaiwiten besteane binne waarnommen yn 'e harsens fan pasjinten mei synucleinopathies 30 .Der is lykwols net folle bekend oer de molekulêre basis fan 'e ynteraksje tusken αS en tau en it meganisme fan syn ko-aggregaasje.αS is rapportearre om ynteraksje mei tau troch in elektrostatyske attraksje tusken de tige negatyf beladen C-terminale regio fan αS en de sintrale proline-rike regio fan tau, dy't ek ferrike is yn posityf laden residuen.
Yn dizze stúdzje litte wy sjen dat αS yndied kin dissociearje yn druppels fia elektrostatyske komplekse kondensaasje yn 'e oanwêzigens fan tau-protein, yn tsjinstelling ta syn ynteraksje mei oare posityf opladen polypeptiden lykas poly-L-lysine (pLK), en yn dit proses.αS fungearret as in steigermolekule foar it druppelnetwurk.Wy hawwe merkbere ferskillen identifisearre yn it proses fan maturaasje fan elektrostatyske αS-koacervaten, dy't ferbûn binne mei ferskillen yn 'e valency en sterkte fan' e ynteraksje fan aaiwiten belutsen by it koacervate netwurk.Ynteressant hawwe wy ko-aggregaasje fan αS- en tau-amyloïdeproteinen yn lange libbene floeibere koacervaten waarnommen en guon wichtige faktoaren identifisearre dy't liede ta ko-aggregaasje fan dizze twa aaiwiten yn sokke koacervaten.Hjir beskriuwe wy yn detail dit proses, dat is in mooglik molekulêre meganisme ûnderlizzende de colocalization fan twa aaiwiten yn sykte-spesifike ynklúzjes.
αS hat in tige anionyske C-terminale sturt by neutraal pH (Fig. 1a), en wy hypoteze dat it koe ûndergean LLPS troch de kondensaasje fan elektrostatyske kompleksen mei polykationic steurde polypeptide molekulen.Wy brûkten in 100-residue poly-L-lysine (pLK) as it startmodelmolekule troch syn posityf opladen en ûnregelmjittige polymere natuer by neutraal pH 32. Earst hawwe wy befêstige dat pLK ynteraksje mei it Ct-domein fan αS fia Solution NMR-spektroskopy (Figure 1b) mei 13C / 15N-labele αS yn 'e oanwêzigens fan tanimmende αS: pLK molêre ferhâldingen.De ynteraksje fan pLK mei it Ct-domein fan αS manifestearret him yn perturbaasjes fan 'e gemyske ferskowing en in ôfnimming fan' e peakintensiteit yn dizze regio fan it proteïne.Nijsgjirrich is dat doe't wy αS mei pLK mingden by in αS-konsintraasje fan likernôch.5-25 µM yn 'e oanwêzigens fan polyetyleenglycol (5-15% PEG-8) (typyske LLPS-buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) gongen wy fuortendaliks troch in breed fjild fan proteïnefoarming .drippen waarden waarnommen mei help fan fluorescence (WF) en helder-fjild (BF) mikroskopy (Fig. 1c).1-5 µm druppels mei konsintrearre αS (tafoege 1 µM AlexaFluor488-label αS, AF488-αS), har elektrostatyske eigenskippen kinne wurde ôflaat fan har wjerstân tsjin 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) en har gefoelichheid foar in ferheging fan NaCl konsintraasje (fig. 1c).De floeistof-like aard fan de coacervates fan de αS / pLK elektrostatyske kompleks wurdt oantoand troch harren fermogen om te fuse binnen millisekonden (Fig. 1d).Mei help fan turbidimetry kwantifisearre wy de formaasje fan druppels ûnder dizze betingsten, befêstige de elektrostatyske aard fan 'e wichtichste ynteraksje dy't ferbûn is mei har stabiliteit (Fig. 1e), en evaluearre it effekt fan ferskate polymearferhâldingen op it LLPS-proses (Fig. 1f).Hoewol dripfoarming wurdt waarnommen oer in breed oanbod fan polymeerferhâldingen, is it proses heul geunstich as pLK mear dan αS is.LLP's binne ek waarnommen mei it chemysk ferskillende ferpleatsmiddel dextran-70 (70 kDa) of mei in ferskaat oan sampleformaten, ynklusyf glêzen slide drops, microplate wells fan ferskate materialen, Eppendorf of quartz capillaries.
in Skematyske foarstelling fan ferskate proteïnegio's yn 'e WT-αS en ΔCt-αS farianten brûkt yn dizze stúdzje.It amfipatyske N-terminale domein, de hydrofobe amyloïde-foarmjende (NAC) regio, en it negatyf opladen C-terminale domein wurde respektivelik yn blau, oranje en read werjûn.De Net Charge Per Residual (NCPR) kaart fan WT-αS wurdt werjûn.b NMR-analyze fan 'e αS / pLK-ynteraksje yn' e ôfwêzigens fan makromolekulêre klompen.As pLK-konsintraasje ferheget (αS: pLK molêre ferhâldingen fan 1: 0.5, 1: 1.5, en 1: 10 wurde respektivelik yn ljochtgrien, grien en donkergrien werjûn).c Coacervate αS/pLK (molêre ferhâlding 1:10) by 25 µM (1 µM AF488-labele αS of Atto647N-labele pLK foar WF-ôfbylding) yn LLPS-buffer (boppe) of oanfolle mei 500 mM NaCl (linksûnder) of nei 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; rjochts ûnder).Skaalbalke = 20 µm.d Representative mikroskopyske bylden fan BF druppelfúzje fan αS / pLK (molêre ferhâlding 1:10) by in konsintraasje fan 25 μM;pylken jouwe de gearfoeging fan yndividuele druppels (reade en giele pylken) oan yn in nije drip (oranje pylk) binnen 200 ms).Skaalbalke = 20 µm.e Ljochtferspriede (by 350 nm) αS / pLK-aggregaasje yn LLPS-buffer foar en nei tafoeging fan 500 mM NaCl of 10% 1,6-HD by 25 µM αS (N = 3 sample replicates, gemiddelde en standertdeviaasje ek oanjûn).f BF-ôfbylding (boppe) en ljochtferstrooiingsanalyze (by 350 nm, ûnderen) fan αS / pLK-aggregaasje by 25 μM αS mei tanimmende αS: pLK molêre ferhâlding (N = 3 sample-replikaten, gemiddelde en standertdeviaasje ek oanjûn).Skaalbalke = 10 µm.De skaalbalke op ien ôfbylding jout de skaal fan alle ôfbyldings yn ien paniel oan.Raw gegevens wurde levere yn 'e foarm fan rau gegevens triemmen.
Op grûn fan ús beoardielingen fan αS/pLK elektrostatyske komplekse kondensaasje en eardere waarnimmings fan αS as in klantmolekule fan it tau/RNA-kondensaat troch direkte ynteraksje mei tau31, stelden wy de hypoteze dat αS en tau mei-inoar skiede koene mei it solvent by it ûntbrekken fan RNA kondensaasje.troch elektrostatyske kompleksen, en αS is it steigerprotein yn αS / Tau-koacervaten (sjoch tau-ladingsferdieling yn figuer 2e).Wy observearre dat doe't 10 μM αS en 10 μM Tau441 (befette respektivelik 1 μM AF488-αS en 1 μM Atto647N-Tau, respektivelik) yn LLPS-buffer mingd waarden, makken se maklik proteïneaggregaten dy't beide aaiwiten befette, lykas sjoen troch WF-mikroskopy.(ôfb. 2a).De kolokalisaasje fan 'e twa aaiwiten yn' e druppels waard befêstige troch konfokale (CF) mikroskopy (Supplementary Fig. 1a).Fergelykber gedrach waard beoardiele doe't dextran-70 brûkt waard as aggregaasjemiddel (Supplementary Fig. 1c).Mei help fan FITC-labele PEG of dextran, fûnen wy dat beide crowding-aginten lykwichtich ferdield waarden oer de samples, dy't gjin segregaasje noch assosjaasje sjen litte (Supplementary Fig. 1d).Earder suggerearret it dat se yn dit systeem fazeskieding befoarderje troch makromolekulêre crowding-effekten, om't PEG in foarkar stabile crowding-agent is, lykas sjoen yn oare LLP-systemen33,34.Dizze proteïne-rike druppels wiene gefoelich foar NaCl (1 M), mar net foar 1,6-HD (10% v / v), befêstigje har elektrostatyske eigenskippen (Supplementary Fig. 2a, b).Har floeibere gedrach waard befêstige troch observearjen fan millisekonden gearfoegjende droplet-eveneminten mei BF-mikroskopie (fig. 2b).
a Confocal (CF) mikroskopyôfbyldings fan αS / Tau441-koacervaten yn LLPS-buffer (10 μM fan elk proteïne, 0.5 μM fan AF488-labele αS en Atto647N-labele Tau441).b Representative differinsjaal ynterferinsje kontrast (DIC) bylden fan αS / Tau441 droplet fúzje eveneminten (10 μM foar elk aaiwyt).c Fasediagram basearre op ljochtferstrooiing (by 350 nm) fan Tau441 LLPS (0-15 µM) yn 'e ôfwêzigens (lofts) of oanwêzigens (rjochts) fan 50 µM αS.Warmere kleuren jouwe mear fersprieding oan.d Ljochtfersprieding fan αS / Tau441 LLPS-samples mei tanimmende αS-konsintraasje (Tau441 by 5 µM, N = 2-3 sample-repetysjes lykas oanjûn).e Skematyske foarstelling fan guon tau-proteinfarianten en ferskate regio's fan it proteïne brûkt yn dizze stúdzje: negatyf opladen N-terminal domein (read), proline-rike regio (blau), mikrotubule-binend domein (MTBD, markearre yn oranje), en amyloid-foarmjende pear spiraal.filamentregio's (PHF) binnen de MTBD (griis).De Net Charge Per Residue (NCPR) kaart fan Tau441 wurdt werjûn.f Gebrûk fan 1 µM AF488-labele αS en Atto647N-labele ΔNt-, mei 1 µM AF488-labele αS of ΔCt-αS yn 'e oanwêzigens fan ΔNt-Tau (boppe, 10 µM per proteïne) of K150 proteïne, per µM ) ) ) mikrografen fan WF kondinsearre yn LLPS of K18 buffer.De skaalbalken yn ien ôfbylding fertsjintwurdigje de skaal fan alle ôfbyldings yn ien paniel (20 µm foar panielen a, b en f).Raw gegevens foar panielen c en d wurde levere as rau gegevens triemmen.
Om de rol fan αS yn dit LLPS-proses te testen, ûndersochten wy earst it effekt fan αS op dripstabiliteit troch nefelometry mei tanimmende konsintraasjes fan NaCl (fig. 2c).Hoe heger de sâltkonsintraasje yn 'e samples dy't αS befetsje, hoe heger de ljochtferstrooiingswearden (by 350 nm), wat de stabilisearjende rol fan αS yn dit LLPS-systeem oanjout.In ferlykber effekt kin wurde waarnommen troch it ferheegjen fan de αS-konsintraasje (en dêrmei de αS:Tau441-ferhâlding) nei ca.10-fâldige ferheging relatyf oan de tau-konsintraasje (5 µM) (fig. 2d).Om te demonstrearjen dat αS in steigerprotein is yn koacervaten, hawwe wy besletten om it gedrach fan 'e LLPS-fersteurde Tau-mutant te ûndersiikjen, dy't in negatyf laden N-terminale regio (residuen 1-150, sjoch Fig. 2e) neamt ΔNt-Tau.WF mikroskopy en nefelometry befêstige dat ΔNt-Tau sels gjin LLPS ûndergie (Fig. 2f en Supplementary Fig. 2d), lykas earder rapportearre 14. Doe't αS lykwols tafoege waard oan dispersjonsoplossingen fan dizze ôfkoarte Tau fariant, wie it LLPS-proses folslein restaurearre mei druppeldichtheid tichtby de druppeltichtens fan oplossingen fan folsleine grutte fan Tau en αS ûnder ferlykbere omstannichheden en proteïnekonsintraasjes.Dit proses kin ek waarnommen wurde ûnder betingsten fan lege makromolekulêre crowding (Supplementary Fig. 2c).De rol fan 'e C-terminale αS-regio, mar net de hiele lingte, yn it LLPS-proses waard oantoand troch ynhibysje fan druppelformaasje mei in C-terminale ôfkoarte αS-fariant sûnder residuen 104-140 (Fig. 1a) fan 'e (ΔCt- αS) protein (Fig. 2f en Oanfoljende Fig. 2d).De kolokalisaasje fan αS en ΔNt-Tau waard befêstige troch konfokale fluoreszensmikroskopy (Supplementary Fig. 1b).
Om it LLPS-meganisme tusken Tau441 en αS fierder te testen, waard in ekstra Tau-fariant brûkt, nammentlik it paired helical filament core (PHF) fragmint yn it mikrotubule-binende domein (MTBD), dat as it fjouwer karakteristike werhellingsdomeinen befettet, algemien ek bekend as it K18-fragmint (sjoch fig. 2e).It is koartlyn rapportearre dat αS foarkar bynt oan in tau-protein dat leit yn in proline-ryk domein yn in folchoarder dy't foarôfgiet oan it mikrotubule-binende domein.De PHF-regio is lykwols ek ryk oan posityf opladen residuen (sjoch figuer 2e), benammen lysine (15% residuen), wat ús frege om te testen oft dizze regio ek bydraacht oan de kondensaasje fan it αS/Tau-kompleks.Wy observearre dat K18 allinich LLPS net koe triggerje by konsintraasjes oant 100 μM ûnder de testen betingsten (LLPS-buffer mei 15% PEG of 20% dextran) (figuer 2f).Lykwols, doe't wy tafoege 50 µM αS oan 50 µM K18, flugge formaasje fan aaiwyt druppels befetsjende K18 en αS waard waarnommen troch nephelometry (Supplementary Fig. 2d) en WF mikroskopy (Fig. 2f).As ferwachte koe ΔCt-αS it LLPS-gedrach fan K18 net werstelle (Fig. 2f).Wy konstatearje dat αS / K18-aggregaasje wat hegere proteïnekonsintraasjes fereasket om LLPS te inducearjen yn ferliking mei αS / ΔNt-Tau of αS / Tau441, oare dingen binne gelyk.Dit is konsekwint mei in sterker ynteraksje fan 'e αS C-terminale regio mei it proline-rike Tau-domein yn ferliking mei it mikrotubule-binende domein, lykas earder beskreaun 31 .
Sjoen dat ΔNt-Tau LLPS net kin útfiere yn 'e ôfwêzigens fan αS, hawwe wy dizze Tau-fariant keazen as model foar it karakterisearjen fan αS / Tau LLPS jûn syn ienfâld yn LLPS-systemen mei Tau fan folsleine lingte (isotype, Tau441 / Tau441).mei komplekse (heterotypyske, αS / Tau441) aggregaasjeprosessen.Wy fergelike de mjitte fan αS-aggregaasje (as part fan it kondensearre fazeprotein, fαS,c) yn 'e αS/Tau- en αS/ΔNt-Tau-systemen troch sintrifugaasje en ferspraat faze SDS-PAGE-analyze (sjoch 2e), fûn hiel ferlykbere wearden foar alle aaiwiten yn deselde konsintraasje.Benammen krigen wy fαS, c 84 ± 2% en 79 ± 7% foar respektivelik αS / Tau en αS / ΔNt-Tau, wat suggerearret dat de heterotypyske ynteraksje tusken αS en tau superieur is oan 'e ynteraksje tusken tau-molekulen.tusken.
De ynteraksje mei ferskate polykations en it effekt fan it kondensaasjeproses op 'e αS-kinetika waarden earst studearre troch de fluoreszensherstel nei photobleaching (FRAP) metoade.Wy testen αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau en αS/pLK koacervaten (100 μM αS oanfolle mei 2 μM αS AF488-αS en 100 μM Tau441 of ΔNt-Tau of 1 mM pLK).Gegevens waarden krigen binnen de earste 30 minuten nei it mingen fan de samplekomponinten.Ut represintative FRAP bylden (fig. 3a, αS / Tau441 condensation) en harren oerienkommende tiid kursus curves (fig. 3b, oanfoljende Fig. 3), kin sjoen wurde dat αS kinetika binne hiel ferlykber mei dy fan Tau441 coacervates.en ΔNt-Tau, dat is folle flugger mei pLK.De berekkene diffusionkoeffisienten foar αS binnen it koacervate neffens FRAP (lykas beskreaun troch Kang et al. 35) binne D = 0.013 ± 0.009 µm2/s en D = 0.026 ± 0.008 µm2/s foar αS/TauS/Δ foar αS/TauS/Δ it αS/-systeem.pLK, Tau, en D = 0,18 ± 0,04 µm2/s respektivelik (fig. 3c).De diffusionskoëffisjint αS yn 'e ferspraat faze is lykwols ferskate oarders fan grutte heger as alle kondinsearre fazen, lykas bepaald troch Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, sjoch Oanfoljende Fig. 3) ûnder deselde betingsten (LLPS buffer) mar yn it ûntbrekken fan polycations (D = 8 ± 4 µm2/s).Dêrom wurdt de kinetika fan αS-oersetting signifikant fermindere yn koacervaten yn ferliking mei proteïnen yn 'e ferspraat faze troch útsprutsen molekulêre crowding-effekten, hoewol alle koacervaten floeibere eigenskippen behâlde yn' e earste healoere nei har formaasje, yn tsjinstelling ta de tau-faze.flugger kinetika yn pLK-kondensaat.
a–c FRAP-analyze fan αS-dynamyk (2% AF488-markearre αS) yn elektrostatyske koacervaten.Fertsjintwurdige bylden fan αS / Tau441 FRAP-assays yn triplikaat wurde werjûn yn (a), wêr't reade sirkels dekleure gebieten oanjaan.De skaalbalke is 5 µm.b Gemiddelde FRAP-kurven en (c) berekkene diffusionskoëffisjinten (D) foar 5-6 (N) ferskillende druppels út trije eksperiminten mei 100 µM αS en ekwimolêre konsintraasjes fan Tau441 (read) of ΔNt-Tau (blau) of pLK (grien) op tsien kear de konsintraasje fan LLPS.De standertdeviaasje fan 'e FRAP-kromme wurdt werjûn yn skaden.Foar fergeliking waard de diffusionskoëffisjint αS yn 'e ferspraat faze yn triplikaat bepaald mei fluoreszenskorrelaasjespektroskopy (FCS) (sjoch Oanfoljende figuer 3 en metoaden foar mear ynformaasje).d Trochrinnende X-band EPR-spektra fan 100 μM TEMPOL-122-αS yn LLPS-buffer sûnder polykation (swart) of yn 'e oanwêzigens fan 100 μM Tau441 (read) of ΔNt-Tau (blau) of 1 mM pLK (grien).De ynset lit in fergrutte werjefte fan 'e sterke fjildlinen sjen wêr't de meast dramatyske feroarings foarkomme.e Bindingskurven fan 50 μM TEMPOL-122-αS mei ferskate polykations yn 'e ôfwêzigens fan LLPS (gjin PEG).De fermindere amplitude fan band III yn ferliking mei band II (IIII / III) fan it normalisearre EPR-spektrum wurdt oanjûn om de molêre ferhâldingen fan Tau441 (read), ΔNt-Tau (blau) en pLK (grien) te ferheegjen.Kleurde linen toane fit oan gegevens mei help fan in rûge binende model mei n identike en ûnôfhinklike binende sites op eltse kromme.Raw gegevens wurde levere yn 'e foarm fan rau gegevens triemmen.
As oanfolling ûndersochten wy de dynamyk fan αS yn ferskate koacervaten mei rjochte spinlabeling (SDSL) en trochgeande elektroanen paramagnetyske resonânsje (CW-EPR).Dizze metoade hat bewiisd tige nuttich te wêzen by it rapportearjen fan de fleksibiliteit en dynamyk fan 'e IDP mei in realistyske oerbliuwende resolúsje36,37,38.Foar dit doel konstruearren wy cysteine-residuen yn ienige Cys-mutanten en brûkten wy de 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spinprobe.Maleimide-derivaten markearje se.Mear spesifyk hawwe wy TEMPOL-probes ynfoege op posysje 122 of 24 αS (TEMPOL-122-αS en TEMPOL-24-αS).Yn it earste gefal rjochtsje wy de C-terminale regio fan it proteïne, dy't belutsen is by ynteraksje mei polykations.Ynstee dêrfan kin posysje 24 ús ynformaasje jaan oer de algemiene dynamyk fan 'e aaiwiten yn' e kondensat.Yn beide gefallen wiene de EPR-sinjalen krigen foar aaiwiten fan 'e ferspraat faze oerien mei nitroxide-radikalen yn' e fluch bewegende steat.Nei faze-skieding yn 'e oanwêzigens fan tau of pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 of ΔNt-Tau yn in ferhâlding fan 1: 1 of pLK yn in ferhâlding fan 1:10), waard in ferheging fan 'e relative peakintensiteit waarnommen yn it EPR-spektrum fan αS.De ferliesline ferbrede, wat oanjout op fermindere αS-reorientaasjekinetika yn druppels yn ferliking mei proteïne yn fertinne faze (Fig. 3d, Oanfoljende Fig. 4a).Dizze wizigingen binne mear útsprutsen op posysje 122. Wylst op posysje 24 de oanwêzigens fan pLK de kinetika fan 'e sonde net beynfloede, op posysje 122 feroare de spektrale linefoarm signifikant (Supplementary Fig. 4a).Doe't wy besochten de spektra te modellearjen op posysje 122 fan twa αS / polycation-systemen mei it isotropyske model (oanfoljende figuer 5a) gewoanlik brûkt om de dynamyk fan spin-labele IDP38,39 te beskriuwen, koene wy ​​de eksperimintele spektra net rekonstruearje..Spektrale simulaasje fan de posysje fan 24 spin kontrasten (oanfoljende figuer 5a).Dit suggerearret dat d'r foarkarposysjes binne yn 'e romte fan spinkonfiguraasjes fan' e C-terminale regio fan αS yn 'e oanwêzigens fan polykations.By it beskôgjen fan de fraksje fan αS yn 'e kondinsearre faze ûnder eksperimintele EPR-betingsten (84 ± 2%, 79 ± 7%, en 47 ± 4% foar respektivelik αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, en αS / pLK - sjoch Supplementary Fig. 2e fan gegevens analyze c), kin sjoen wurde dat de ferbreding ûntdutsen troch de EPR metoade benammen wjerspegelet de ynteraksje fan de C-terminal regio fan αS mei ferskate polycations yn de kondensearre faze (de wichtichste feroaring by it brûken fan TEMPOL-122- αS), en net proteïnekondensaasje.In ferheging fan mikroviskositeit wurdt waarnommen yn 'e sonde.As ferwachte waard it EPR-spektrum fan it proteïne ûnder oare betingsten as LLPS folslein restaurearre doe't 1 M NaCl oan it mingsel tafoege waard (Supplementary Fig. 4b).Oer it algemien suggerearje ús gegevens dat de feroaringen ûntdutsen troch CW-EPR benammen de ynteraksje fan 'e C-terminale regio fan αS reflektearje mei ferskate polykations yn' e kondensearre faze, en dizze ynteraksje liket sterker te wêzen mei pLK dan mei Tau.
Om mear strukturele ynformaasje te krijen oer de aaiwiten yn it koacervate, besleaten wy it LLPS-systeem te studearjen mei NMR yn oplossing.Wy koenen lykwols allinich de αS-fraksje ûntdekke dy't oerbleaun is yn 'e ferspraat faze, wat kin wêze fanwege fermindere proteïndynamyk yn' e koacervate en in dichte faze oan 'e boaiem fan' e oplossing yn NMR-analyse.Doe't wy de struktuer en dynamyk fan it proteïne oerbleaun yn 'e ferspraat faze fan' e LLPS-probe analysearren mei NMR (Supplementary Fig. 5c, d), merkten wy op dat it proteïne hast identyk gedrage yn 'e oanwêzigens fan pLK en ΔNt-Tau, beide fan dy't wiene yn sekundêre struktuer en dynamyk fan it proteïne rêchbonke, iepenbiere troch eksperiminten op sekundêre gemyske ferskowing en R1ρ ûntspanning.NMR-gegevens litte sjen dat de C-terminus fan αS in signifikant ferlies lijt fan konformaasjefleksibiliteit, wylst syn ûnorderlike natuer behâldt, lykas de rest fan 'e proteïnesekwinsje, troch syn ynteraksjes mei polykations.
Sûnt de ferbreding fan it CW-EPR-sinjaal waarnommen yn 'e TEMPOL-122-αS-kondensearre faze de ynteraksje fan it proteïne mei polykations wjerspegelet, hawwe wy in EPR-titraasje útfierd om de binende affiniteit fan αS oan ferskate polykations te evaluearjen yn it ûntbrekken fan LLPS (gjin accumulation fan Buffer LLPS), suggerearret dat de ynteraksjes itselde binne yn verdunde en konsintrearre fazen (dat wurdt befêstige troch ús gegevens, Oanfoljende Fig. 4a en Oanfoljende Fig. 6).It doel wie om te sjen oft alle koacervaten, nettsjinsteande har mienskiplike floeistoflike eigenskippen, elk ûnderlizzend differinsjaal gedrach op molekulêr nivo sjen litte.As ferwachte waard it EPR-spektrum ferbrede mei tanimmende polykation-konsintraasje, wat in fermindering fan molekulêre fleksibiliteit reflekteart troch molekulêre ynteraksjes fan alle ynteraksjepartners hast oant sêding (Fig. 3e, Oanfoljende Fig. 6).pLK berikte dizze sêding op in legere molêre ferhâlding (polycation: αS) yn ferliking mei ΔNt-Tau en Tau441.Yn feite, fergeliking fan de gegevens mei in ûngefear binend model oannommen fan n identike en ûnôfhinklike binende sites die bliken dat de skynbere dissociation konstante fan pLK (~ 5 μM) is in folchoarder fan grutte leger as dy fan Tau441 of ΔNt-Tau (~ 50 μM ).µM).Hoewol dit in rûge skatting is, suggerearret dit dat αS in hegere affiniteit hat foar ienfâldiger polykations mei trochgeande positive ladingsregio's.Mei it each op dit ferskil yn affiniteit tusken αS en ferskate polykations, hawwe wy hypoteze dat har floeibere eigenskippen mei de tiid oars kinne feroarje en sadwaande lije fan ferskate LSPT-prosessen.
Sjoen de heul drokte omjouwing binnen it proteïne coacervate en de amyloïde aard fan it proteïne, observearren wy it gedrach fan 'e coacervate oer de tiid om mooglike LSPT-prosessen te detektearjen.Mei help fan BF- en CF-mikroskopie (figuer 4), hawwe wy observearre dat αS / Tau441 foar in grut part yn oplossing koacervate, en foarmje grutte drippen dy't kontakt opnimme en it oerflak oan 'e boaiem fan' e put / slide as folsleine drippen, lykas ferwachte (oanfoljende Fig. 7d);wy neame dizze boaiem-foarme struktueren "protein rafts".Dizze struktueren bleaunen floeiend, om't se de mooglikheid behâlden om te fusearjen (oanfoljende figuer 7b) en koe wurde sjoen foar ferskate oeren nei't LLPS útlutsen waard (figuer 4 en oanfoljende figuer 7c).Wy konstatearre dat it wetting proses wurdt begeunstige op it oerflak fan hydrophilic ynstee hydrophobic materialen (Supplementary Fig. 7a), lykas ferwachte foar electrostatic coacervates mei unbalanced ladingen en dus hege electrostatic oerflak potentials.Opmerklik waarden αS / ΔNt-Tau-koalesinsje en rafting signifikant fermindere, wylst αS / pLK-kondensaten signifikant fermindere waarden (figuer 4).Tidens de koarte ynkubaasjetiid koene de αS / pLK-druppels it hydrofile oerflak koalesearje en wiet, mar dit proses stoppe gau en nei 5 oeren fan ynkubaasje waarden allinich beheinde koalesinsje-eveneminten en gjin wieting waarnommen.- gel-drip oergong.
Fertsjintwurdiger BF (griisskaalpanielen) en CF (rjochterpanielen, AF488-labele αS yn grien) fan koacervate-monsters dy't 100 µM αS (1% fluorescent label) befetsje yn LLPS-buffer yn 'e oanwêzigens fan 100 µM Tau441 (boppeste) fluorescens ΔN mikroskopyske ôfbyldings ΔN -Tau (sintrum) of 1 mM pLK (boaiem) op ferskillende incubation tiden en fokale hichten (z, ôfstân fan 'e boaiem fan' e plaat goed).De eksperiminten waarden werhelle 4-6 kear ûnôfhinklik fan elkoar mei deselde resultaten.αS/Tau441-koacervaten wurde nei 24 oeren wiette, en foarmje rafts grutter dan de ôfbylding.De skaalbalke foar alle ôfbyldings is 20 µm.
Wy fregen doe oft de grutte fluid-like proteïnepools foarme yn αS / Tau441 LLPS soe liede ta amyloïde-aggregaasje fan ien fan 'e ûndersochte aaiwiten.Wy folgen de maturaasje fan αS / Tau441-druppels oer de tiid mei WF-mikroskopie ûnder deselde betingsten as hjirboppe, mar mei 1 μM AF488-labele αS en Atto647N-labele Tau441 (fig. 5a).Lykas ferwachte, observearren wy folsleine proteïnelokalisaasje yn 't heule rypingsproses.Opfallend is dat fan ca.Nei 5 oeren waarden mear yntinsive net-sirkulêre struktueren binnen de rafts beoardiele, dy't wy "punten" neamden, wêrfan guon waarden colocalized mei αS, en guon waarden ferrike yn Tau441 (Fig. 5a, wite pylken).Dizze flekken binne altyd binnen raften yn gruttere mjitte waarnommen foar αS/ΔNt-Tau as foar αS/ΔNt-Tau.D'r wiene gjin ûnderskate plakken yn 'e druppels fan pLK- en Tau-systemen dy't net kompetint wiene foar fúzje / wietsjen.Om te testen oft dizze flekken dy't αS en Tau441 befetsje binne amyloïde-like aggregaten, hawwe wy in ferlykber eksperimint útfierd mei CF-mikroskopie wêryn Tau441 waard markearre mei Atto647N en 12.5 μM amyloïde-spesifike thioflavine-T (ThT) waard fanôf it begjin tafoege.ferve.Hoewol ThT-kleuring fan αS / Tau441-druppels of rafts waard net beoardiele, sels nei 24 h fan ynkubaasje (Fig. 5b, boppeste rige - oerbleaune druppels oer proteinflotten), ThT-positive struktueren dy't Atto647N-Tau441 yn 'e vlotten befetsje, wiene tige swak.dit replicates de grutte, foarm en lokaasje fan de earder beskreaune spots (fig. 5b, middelste en ûnderste rigen), wat suggerearret dat de spots kinne oerienkomme mei amyloid-lykas aggregates foarme yn fergrizing floeistof coacervates.
WF 25 μM αS by ferskate ynkubaasjetiden en fokale hichten (z, ôfstân fan unbound boaiem) yn 'e oanwêzigens fan 25 μM Tau441 (1 μM AF488-labele αS en Atto647N-labele Tau441) yn in put fan in mikroskoopplaat mei LLPS-buffer) .Seis eksperiminten waarden ûnôfhinklik werhelle mei ferlykbere resultaten.b CF mikroskopysk byld fan 25 μM αS yn 'e oanwêzigens fan 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-labele Tau441) en 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Gewogen proteïnedruppels en deponearre proteïnflotten en spots wurde respektivelik yn 'e boppeste en middelste rigen werjûn.De ûnderste rige toant ôfbyldings fan rafts en drippen fan 3 ûnôfhinklike replikaten.Wite pylken jouwe ThT-positive stippen yn beide panielen oan.De skaalbalke foar alle ôfbyldings is 20 µm.
Om de wizigingen yn it koacervateproteinnetwurk yn mear detail te ûndersiikjen tidens de oergong fan floeistof nei fêst, brûkten wy fluorescence lifetime imaging (FLIM) en Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (figuer 6 en oanfoljende figueren 8 en 9).Wy hypoteze dat de coacervate maturation fan 'e laach yn in mear kondinsearre of sels solide-like aggregearre proteïnestruktuer liedt ta nauwer kontakt tusken it proteïne en de fluorescent probe dy't dêroan hechte is, en mooglik in quenching-effekt produsearje dy't manifestearre yn in ferkoarte probelibben (τ) , lykas earder beskreaun40.,41,42.Dêrnjonken kin dizze fermindering yn τ ek begelaat wurde troch koacervate-kondensaasje en in ferheging fan FRET (E)-effisjinsje tidens LSPT foar dûbel-labelde samples (AF488 en Atto647N as respektivelik FRET-donor- en akseptorkleurstoffen).Wy kontrolearren float- en spotformaasje oer tiid yn LLPS αS/Tau441 en αS/ΔNt-Tau-samples (25 µM fan elk proteïne yn LLPS-buffer mei 1 µM AF488 markearre αS en/of Atto647N markearre Tau441 of ΔNt-Tau).Wy observearre in algemiene trend yn dat de fluorescence libbensdoer fan 'e AF488 (τ488) en Atto647N (τ647N) probes wat ôfnommen as de coacervates matured (Fig. 6 en Supplementary Fig. 8c).Ynteressant waard dizze feroaring signifikant fersterke foar stippen binnen rafts (fig. 6c), wat oanjout dat fierdere proteïnekondensaasje barde by punten.Om dit te stypjen waard gjin signifikante feroaring yn fluoreszenslibben waarnommen foar αS / ΔNt-Tau-druppels dy't 24 h âld binne (oanfoljende Fig. 8d), wat suggerearret dat dripgelaasje in proses is dat ûnderskiedt fan spotting en dat net begelaat wurdt troch signifikante molekulêre reorganisaasje binnen koacervaten.Dêrby moat opmurken wurde dat de stippen hawwe ferskillende maten en fariabele ynhâld yn αS, benammen foar de αS / Tau441 systeem (oanfoljende Fig. 8e).De ôfnimming fan it libben fan spotfluoreszens waard begelaat troch in ferheging fan yntinsiteit, benammen foar Atto647N markearre Tau441 (Supplementary Fig. 8a), en hegere FRET-effisjinsjes foar sawol αS / Tau441 en αS / ΔNt-Tau-systemen, wat oanjout op fierdere kondensaasje yn LLPS Fiif oeren nei triggering, de aaiwiten binnen de statyske elektrisiteit condensed.Yn ferliking mei αS/ΔNt-Tau observearren wy legere τ647N en wat hegere τ488-wearden yn αS/Tau441-spots, begelaat troch legere en mear inhomogene FRET-wearden.Mooglik kin dit ferbân hâlde mei it feit dat yn it αS/Tau441-systeem de waarnommen en ferwachte αS-oerfloed yn aggregaten mear heterogeen is, faaks substoichiometrysk yn ferliking mei Tau, om't Tau441 sels ek LLPS en aggregaasje ûndergean kin (Supplementary Fig. 8e) .De graad fan druppelkoalesinsje, raftfoarming, en, wichtich, proteïnaggregaasje binnen floeibere koacervaten is lykwols maksimaal as sawol Tau441 as αS oanwêzich binne.
a Lifetime fluorescence mikroskopy (FLIM) bylden fan αS / Tau441 en αS / ΔNt-Tau by 25 μM fan elk aaiwyt (1 μM AF488-labele αS en 1 μM Atto647N-labele Tau441 of ΔNt-Tau) buffer.De kolommen litte represintative bylden fan LLPS-samples sjen op ferskate maturaasjetiden (30 min, 5 h en 24 h).It reade ramt lit de regio sjen mei αS/Tau441-flekken.Life spans wurde werjûn as kleur bars.Skaalbalke = 20 µm foar alle ôfbyldings.b Ynzoomd FLIM-ôfbylding fan it selektearre gebiet, werjûn yn it reade fak yn paniel a.Life ranges wurde werjûn mei deselde kleur skaal as yn paniel a.Skaalbalke = 5 µm.c Histogrammen dy't AF488 sjen litte (taheakke oan αS) of Atto647N (taheakke oan Tau) foar ferskate proteïnesoarten (druppels-D-, raft-R- en speckle-P) identifisearre yn FLIM-ôfbyldings opnommen foar αS-) timing-distribúsjes libben fan Tau441 en αS / ΔNt-Tau coacervate-samples (N = 17-32 ROI foar D, 29-44 ROI foar R, en 21-51 ROI foar punten).Gemiddelde en mediaanwearden wurde respektivelik werjûn as giele fjilden en swarte linen yn fakjes.De legere en boppegrins fan it fak fertsjintwurdigje respektivelik de earste en tredde kwartilen, en de minimale en maksimale wearden binnen it 1.5-fold ynterkwartile berik (IQR) wurde werjûn as whiskers.Outliers wurde werjûn as swarte diamanten.Statistyske betsjutting tusken pearen fan distribúsjes waard bepaald mei in twa-sample t-test, oannommen fan ûngelikense fariaasjes.Twa-tailed t-test p-wearden wurde werjûn mei asterisken foar elk pear fergelike gegevens (* p-wearde > 0.01, ** p-wearde > 0.001, *** p-wearde > 0.0001, **** p-wearde> 0,00001), ns Jout negligibility oan (p-wearde> 0,05).De krekte p-wearden wurde jûn yn oanfoljende tabel 1, en de orizjinele gegevens wurde presintearre as rauwe gegevensbestannen.
Om de amyloïde-like aard fan spikkels / aggregaten fierder te demonstrearjen, behannelen wy unstained coacervate-samples foar 24 oeren mei hege konsintraasjes fan (1 M) NaCl, wat resultearre yn 'e skieding fan aggregaten fan protein-coacervates.Doe't isolearre aggregaten (dat wol sizze, in ferspraat oplossing fan aggregaten) waarden waarnommen mei help fan atomic force microscopy (AFM), wy observearre in oerwegend sfearyske morfology mei in reguliere hichte fan likernôch 15 nm, dy't tend to assosjearje ûnder omstannichheden fan hege sâlt konsintraasje, fergelykber mei it gedrach fan typyske amyloïde fibrillen troch it sterke hydrofobe effekt op it oerflak (tink dat fibrillen typysk in hichte hawwe fan ~10 nm) (oanfoljende Fig. 10a).Ynteressant, doe't isolearre aggregaten waarden ynkubearre mei ThT yn in standert ThT fluorescence assay, wy observearre in dramatyske ferheging fan ThT fluorescence kwantum opbringst, fergelykber mei dat waarnommen doe't de kleurstof waard ynkubearre mei typyske αS amyloïde fibrils (oanfoljende Fig. 10b), wat suggerearret dat de koacervate-aggregaten befetsje amyloïde-like struktueren..Yn 't feit wiene de aggregaten tolerant foar hege sâltkonsintraasjes, mar gefoelich foar 4 M guanidinechloride (GdnHCl), lykas typyske amyloïde fibrillen (Supplementary Fig. 10c).
Dêrnei analysearren wy de gearstalling fan 'e aggregaten mei fluoreszinsje fan ien molekule, spesifike fluoreszenskorrelaasje / krúskorrelaasjespektroskopy (FCS / FCCS), en burstanalyze fan deteksje fan twa-kleur oerienkomst (TCCD).Dêrta isolearren wy aggregaten foarme nei 24 oeren fan ynkubaasje yn 100 μl LLPS-samples mei αS en Tau441 (beide 25 μM) tegearre mei 1 μM AF488-labele αS en 1 μM Atto647N-labele Tau4411.Ferwiderje de resultearjende ferspraat aggregaatoplossing nei in monomolekulêre steat mei deselde PEG-frije buffer en 1 M NaCl (deselde buffer brûkt om aggregaten te skieden fan koacervate) om alle mooglike elektrostatyske ynteraksjes tusken LLPS en proteïne te foarkommen.In foarbyld fan it tiidstrajekt fan in inkele molekule is te sjen yn figuer 7a.FCCS/FCS-analyze (cross-correlation, CC en autocorrelation, AC) lieten sjen dat aggregaten dy't αS en tau befetsje yn 'e samples oerfloedich wiene (sjoch CC-kromme yn Fig. resultaat fan it verdunningsproses (sjoch AC-kurven yn figuer 7b, lofterpaniel).Kontrôle eksperiminten útfierd ûnder deselde oplossing betingsten mei help fan samples dy't befetsje allinnich monomere aaiwiten lieten gjin CC curves, en de AC curves passe goed mei de ien-komponint diffusion model (Eq. 4), dêr't monomeric aaiwiten hawwe de ferwachte diffusion koeffizienten (figuer 7b) ), rjochter paniel).De diffusionskoëffisjint fan aggregearre dieltsjes is minder dan 1 µm2/s, en dy fan monomere aaiwiten is sawat 1 µm2/s.50-100 µm/s;wearden binne fergelykber mei earder publisearre wearden foar sonicated αS amyloïde fibrillen en monomere αS apart ûnder ferlykbere oplossing betingsten44.Doe't wy de aggregaten analysearren mei TCCD-eksploazjeanalyze (Fig. 7c, boppeste paniel), fûnen wy dat yn elke isolearre aggregaat (αS / Tau heteroaggregate), sawat 60% fan 'e ûntdutsen aggregaten sawol αS as tau befette, sawat 30% allinich befette tau, sawat 10% allinich αS.Stoichiometryske analyze fan αS/Tau heteroaggregaten liet sjen dat de measte heteroaggregaten ferrike waarden yn tau (stoichiometrie ûnder 0,5, it gemiddelde oantal tau-molekulen per aggregaat is 4 kear mear as αS-molekulen), wat oerienkomt mei ús wurk dat yn FLIM in situ is waarnommen. eksperiminten..FRET-analyze liet sjen dat dizze aggregaten beide aaiwiten befette, hoewol de eigentlike FRET-wearden yn dit gefal net fan grut belang binne, om't de ferdieling fan fluorofoaren yn elk aggregaat willekeurich wie fanwegen in oerskot oan unlabele proteïne brûkt yn it eksperimint.Nijsgjirrich is dat doe't wy deselde analyze útfierden mei de 45,46 mature amyloïde aggregaasje-deficient Tau fariant (sjoch Oanfoljende Fig. 11a, b), hawwe wy opmurken dat hoewol de αS elektrostatyske aggregaasje itselde wie (Supplementary Fig. 11c, d), de mooglikheid om aggregaten te foarmjen binnen it koacervate waard drastysk fermindere en FLIM ûntduts ferskate plakken yn in situ eksperiminten, en swakke krúskorrelaasjekurven waarden waarnommen foar isolearre aggregaatmonsters.Foar in lyts oantal ûntdutsen aggregaten (mar ien tsiende fan Tau441) konstatearren wy lykwols dat elk aggregaat ferrike wie yn αS dan dizze Tau-fariant, mei sawat 50% fan 'e ûntdutsen aggregaten dy't allinich αS-molekulen befette, en αS wie iterogeneen yn oerfloed .aggregates (sjoch Oanfoljende Fig. 11e), yn tsjinstelling ta de heterogene aggregates oanmakke troch Tau441 (Fig. 6f).De resultaten fan dizze eksperiminten lieten sjen dat alhoewol't αS sels yn steat is om te sammeljen mei tau binnen it koacervate, tau nucleation is geunsticher ûnder dizze betingsten, en de resultearjende amyloïde-like aggregaten kinne fungearje as in foarm fan αS en tau.Lykwols, ienris in tau-rike kearn wurdt foarme, heterotypyske ynteraksjes tusken αS en tau wurde begeunstige yn aggregaten oer homotypic ynteraksjes tusken tau molekulen;wy observearje ek proteïne netwurken yn floeibere αS / tau coacervates.
a Representative fluorescence tydlike spoaren fan inkele molekulen fan isolearre aggregaten foarme yn αS / Tau441 elektrostatyske coacervates.Bursts dy't oerienkomme mei αS / Tau441 coaggregates (barsten boppe de oantsjutte drompel) waarden waarnommen yn trije detection kanalen (AF488 en Atto647N emission nei direkte excitation, blauwe en reade linen, Atto647N emission nei yndirekte excitation), FRET, violet line).b FCS / FCCS-analyze fan in stekproef fan isolearre αS / Tau441-aggregaten krigen fan LLPS (loftspaniel).Autokorrelaasje (AC)-kurven foar AF488 en Atto647N wurde respektivelik yn blau en read werjûn, en krúskorrelaasje (CC)-kurven ferbûn mei aggregaten dy't beide kleurstoffen befetsje wurde yn pears werjûn.De AC-kurven wjerspegelje de oanwêzigens fan markearre monomere en aggregearre proteïnesoarten, wylst de CC-kurven allinich de fersprieding fan dûbel-labelde aggregaten sjen litte.Deselde analyse, mar ûnder deselde oplossingsbetingsten as yn isolearre spots, wurde samples dy't allinich monomere αS en Tau441 befetsje, as kontrôles yn it rjochterpaniel werjûn.c Fluorescence flash analyze fan inkele molekulen fan isolearre aggregates foarme yn αS / Tau441 elektrostatyske coacervates.Ynformaasje foar elk aggregaat fûn yn fjouwer ferskillende werhellingen (N = 152) wurdt útset tsjin har stoichiometry, S-wearden en FRET-effisjinsje (boppeste paniel, kleurbalke wjerspegelet foarkommen).Trije soarten aggregaten kinne wurde ûnderskieden: -αS-allinnich aggregaten mei S~1 en FRET~0, Tau-allinnich aggregaten mei S~0 en FRET~1, en heterogene Tau/αS-aggregaten mei tuskenlizzende S en FRET Skattings fan it bedrach fan beide markerproteinen ûntdutsen yn elke heterogene aggregaat (N = 100) wurde werjûn yn it legere paniel (de kleurskaal reflektet it foarkommen).Raw gegevens wurde levere yn 'e foarm fan rau gegevens triemmen.
De maturaasje of ferâldering fan floeibere proteïnekondensaten yn gel-like of fêste struktueren yn 'e rin fan' e tiid is rapportearre te wêzen belutsen by ferskate fysiologyske funksjes fan 'e condensate47 likegoed as by sykte, as in abnormaal proses foarôfgeand oan amyloïde aggregaasje 7, 48, 49. Hjir wy studearje fazeskieding en gedrach yn detail.LSPT αS yn 'e oanwêzigens fan willekeurige polykations yn in kontroleare omjouwing by lege mikromolêre konsintraasjes en fysiologysk relevante betingsten (tink derom dat de berekkene fysiologyske konsintraasje fan αS> 1 µM50 is), nei typysk thermodynamysk oandreaune gedrach fan LPS.Wy fûnen dat αS, dy't in tige negatyf beladen C-terminale regio by fysiologyske pH befettet, yn steat is om proteïnerike druppels te foarmjen yn wetterige oplossing fia LLPS yn 'e oanwêzigens fan heul kationyske ûnregelmjittige peptiden lykas pLK of Tau troch it proses fan elektrostatyske komplekse kondensaasje yn 'e oanwêzigens fan aggregaasje makromolekulen.Dit proses kin relevante effekten hawwe yn 'e sellulêre omjouwing wêr't αS ferskate polykationyske molekulen tsjinkomt dy't ferbûn binne mei syn sykte-assosjearre aggregaasje sawol in vitro as in vivo51,52,53,54.
Yn in protte stúdzjes is proteïndynamyk binnen druppels beskôge as ien fan 'e kaaifaktoaren dy't it rypjenproses bepale55,56.Yn elektrostatyske αS coacervates mei polycations, it maturation proses blykber hinget ôf fan de sterkte fan ynteraksjes mei polycations, de valence, en de mearfâldichheid fan dizze ynteraksjes.De lykwichtsteory suggerearret dat in lykwichtlânskip fan twa floeibere steaten de oanwêzigens wêze soe fan in grutte dripke ryk oan biopolymeren dy't LLPS57,58 driuwe.Druppelgroei kin berikt wurde troch Ostwald maturation59, coalescence60 of konsumpsje fan frije monomeren yn 'e ferspraat faze61.Foar αS en Tau441, ΔNt-Tau of pLK, it grutste part fan it aaiwyt waard konsintrearre yn it kondensat ûnder de betingsten brûkt yn dizze stúdzje.Hoewol, wylst tau-druppels fan folsleine grutte rap koalesearren by oerflakbewetting, wiene dripkoalesinsje en wietting lestich foar ΔNt-Tau en pLK, wat suggerearret in rap ferlies fan floeibere eigenskippen yn dizze twa systemen.Neffens ús FLIM-FRET-analyze lieten de âldere pLK- en ΔNt-Tau-druppels in ferlykbere graad fan proteïnaggregaasje (fergelykbere fluoreszenslibben) sjen as de orizjinele druppels, wat suggerearret dat it orizjinele proteïne netwurk waard behâlden, hoewol mear rigid.
Wy rationalisearje ús eksperimintele resultaten yn it folgjende model (figuer 8).De ynearsten tydlik foarme druppels binne faak proteïne netwurken sûnder elektrostatyske kompensaasje, en dus binne der gebieten fan lading ûnbalâns, benammen by de droplet ynterface, resultearret yn druppels mei in hege elektrostatyske oerflak potinsjeel.Om te kompensearjen foar lading (in ferskynsel dat faaks oantsjutten wurdt as valence útputting) en minimalisearje it oerflak potinsjeel fan 'e druppeltjes, de druppels kinne omfetsje nije polypeptides út' e verdunde faze, reorganisearje proteïne netwurken te optimalisearjen lading-lading ynteraksjes, en ynteraksje mei oare druppels.mei oerflakken (wetting).De αS / pLK-druppels, troch har ienfâldiger proteïne-netwurk (allinich heterotypyske ynteraksjes tusken αS en pLK) en gruttere affiniteit foar proteïne-proteïne-ynteraksjes, lykje de lading fan 'e kondensaat flugger te balansearjen;yndie, wy observearre flugger proteïne kinetika yn ynearsten foarme αS / pLK coacervates as yn αS / Tau.Nei valence útputting, de ynteraksjes wurde minder efemere en de druppels ferlieze harren floeibere eigenskippen en feroarje yn gel-like, net-flammable druppels mei in leech elektrostatyske oerflak potinsjeel (en dus net yn steat om wiet it oerflak).Yn tsjinstelling binne αS / Tau-druppels minder effisjint by it optimalisearjen fan druppelladingsbalâns fanwegen kompleksere proteïnetwurken (mei sawol homotypyske as heterotypyske ynteraksjes) en de swakkere aard fan proteïne-ynteraksjes.Dit resulteart yn druppels dy't floeiber gedrach foar langere perioaden behâlde en in hege elektrostatyske oerflakpotinsjeel fertoane dy't de neiging hat om te minimalisearjen troch koalescearjen en groeien (dus it minimalisearjen fan it oerflak / folume-ferhâlding fan 'e druppels) en troch it wetterjen fan 'e hydrofiele oerflakkem.Dit soarget foar grutte konsintrearre proteïnebiblioteken dy't floeiende eigenskippen behâlde, om't de ynteraksjes tige foarby bliuwe troch it konstante sykjen nei ladingoptimalisaasje yn it proteïnetwurk.Nijsgjirrich is dat N-terminaal ôfkoarte foarmen fan Tau, ynklusyf guon natuerlik foarkommende isofoarmen62, tuskenbedrach fertoane, mei guon koacervaten ferâldere mei αS yn langlibbene gel-like druppels, wylst oaren transformearje yn grutte floeibere kondensaten.Dizze dualiteit yn 'e maturation fan αS elektrostatyske koacervaten is konsistint mei resinte LLPS teoretyske en eksperimintele stúdzjes dy't in korrelaasje hawwe identifisearre tusken valence-útputting en elektrostatyske sieding yn kondensaten as in kaai foar it kontrolearjen fan kondensatgrutte en floeistofeigenskippen.Mechanisme 58.61.
Dit skema toant de putative amyloïde aggregaasjepaad foar αS en Tau441 fia LLPS en LSPT.Mei ekstra anion-rike (reade) en kation-rike (blauwe) regio's, αS en tau elektrostatyske koacervaten mei befredigjend valence hawwe legere oerflak enerzjy en dus minder koalescence, resultearret yn flugge droplet fergrizing.In stabile net-agglomerearre gel-status wurdt berikt..Dizze situaasje is tige geunstich yn it gefal fan it αS / pLK-systeem troch syn hegere affiniteit en ienfâldiger proteïne-pear-ynteraksjenetwurk, wat in rappe gel-like oergong mooglik makket.Krektoarsom, druppels mei ûnfoldwaande valence en, dêrom, proteïne-opladen regio's beskikber foar ynteraksje, meitsje it makliker foar de coacervate te fusearjen en wiet it hydrophilic oerflak om te ferminderjen syn hege oerflak enerzjy.Dizze situaasje is de foarkar foar αS / Tau441-koacervaten, dy't in multyvalent kompleks netwurk hawwe besteande út swakke Tau-Tau- en αS-Tau-ynteraksjes.Op har beurt sille gruttere koacervaten har floeistoflike eigenskippen makliker behâlde, wêrtroch oare proteïne-oan-protein-ynteraksjes foarkomme kinne.Uteinlik foarmje amyloïde heterogene aggregaten dy't sawol αS as tau befetsje binnen de koacervate floeistof, dy't relatearre wurde kinne oan dy fûn yn ynklúzjelichems, dy't skaaimerken binne fan neurodegenerative sykten.
De grutte floeistof-like struktueren foarme tidens maturation fan αS / Tau441 mei in tige congested, mar dynamyske proteïne omjouwing en, yn mindere mjitte, αS / ΔNt-Tau coacervates binne ideale reservoirs foar de nucleation fan aaiwyt aggregaasje.Wy hawwe yndie de formaasje fan fêste proteïneaggregaten yn dit soarte proteïne-koacervaten waarnommen, faaks befetsje sawol αS as tau.Wy hawwe sjen litten dat dizze heteroaggregates wurde stabilisearre troch net-elektrostatyske ynteraksjes, binne by steat om te binen amyloid-spesifike ThT kleurstoffen op deselde wize as typyske amyloid fibrils, en yndie hawwe ferlykbere wjerstân tsjin ferskate ynfloeden.De αS / tau-aggregaten foarme troch LLPS waarden oantoand om amyloïde-like eigenskippen te hawwen.Yndied, de folwoeksen fariant fan Tau tekoart oan amyloïde aggregaasje is signifikant beheind yn 'e formaasje fan dizze heterogene αS-aggregaten binnen it floeibere elektrostatyske koacervate.De formaasje fan αS / Tau441-aggregaten waard allinich binnen de koacervaten waarnommen, dy't flüssige eigenskippen behâlden, en nea, as de koacervaten / druppels de gelstate net berikten.Yn it lêste gefal foarkomme de ferhege sterkte fan elektrostatyske ynteraksjes en, as gefolch, de rigiditeit fan it proteïne netwurk de needsaaklike konformaasjerearrangements fan proteïnen om nije proteïne-ynteraksjes te fêstigjen dy't nedich binne foar amyloïde nukleaasje.Dit kin lykwols berikt wurde yn fleksibeler, flüssige koacervaten, dy't op har beurt earder flüssig bliuwe as se yn grutte tanimme.
It feit dat de formaasje fan aggregaten binnen de kondinsearre faze de foarkar is yn grutte αS / Tau-kondensaten as yn lytse dripkes dy't rap gelearje, markeart de relevânsje fan it identifisearjen fan de faktoaren dy't dripkoalescinsje kontrolearje.Sa is d'r net allinich in oanstriid foar fazeskieding, mar moat de grutte fan it kondensaat kontrolearre wurde foar goed funksjonearjen en ek sykteprevinsje58,61.Us resultaten markearje ek it belang fan it lykwicht tusken LLPS en LSPT foar it αS / Tau-systeem.Wylst druppelformaasje kin beskermje tsjin amyloïde-aggregaasje troch it ferminderjen fan it bedrach fan proteïnemonomeren dy't beskikber binne ûnder sêdingsbetingsten, lykas is foarsteld yn oare systemen63,64, druppelfúzje op hege druppelnivo's kin liede ta ynterne proteïnaggregaasje troch trage konformaasje-feroarings.protein netwurken..
Oer it algemien beklamje ús gegevens sterk de relevânsje fan gearhingjende valens en tefreden / net tefreden ynteraksjes yn dropnetwurken yn 'e kontekst fan LSPT.Yn 't bysûnder litte wy sjen dat αS / Tau441-kondensaten mei folsleine lingte yn steat binne om effisjint te fusearjen en te kearnen om amyloïde-like heteroaggregaten te foarmjen dy't beide aaiwiten omfetsje en in molekulêre meganisme foarstelle op basis fan ús eksperimintele resultaten.De ko-aggregaasje fan twa aaiwiten yn it αS/Tau floeistof koacervate dat wy hjir rapportearje kin yndie ferbân wêze mei de ko-lokalisaasje fan twa aaiwiten yn ynklúzjes, dy't skaaimerken binne fan 'e sykte, en kin bydrage oan it begripen fan' e relaasje tusken LLPS en amyloïde aggregaasje, it paad foar heech opladen IDP yn neurodegeneraasje.
Monomere WT-αS, cysteine ​​mutanten (Q24C-αS, N122C-αS) en ΔCt-αS farianten (Δ101-140) waarden útdrukt yn E. coli en suvere lykas earder beskreaun.5 mM DTT waard opnommen yn alle stappen yn 'e suvering fan αS-cysteine-mutanten om disulfidebânfoarming te foarkommen.Tau441 isoform (plasmide krigen fan Addgene #16316), ΔNt-Tau fariant (Δ1-150, krigen troch klonearjen fan IVA mei primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) en AggDef-2CT,5C purified mei EGGDef-1CT,5C. coli-kultueren wiene groeid ta OD600 = 0.6-0.7 by 37 ° C en 180 rpm, en ekspresje waard ynducearre mei IPTG foar 3 oeren by 37 ° C.Harvest sellen by 11.500 xg foar 15 min by 4 ° C en waskje mei salinebuffer mei 150 mM NaCl.Resuspendearje de pellet yn lysisbuffer (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100).De sonication stap waard útfierd op iis mei in amplitude fan 80% foar 10 pulses (1 min oan, 1 min út).Net mear as 60 ml yn ien echografie.E. coli lysates waarden ferwaarme op 95 ° C. foar 20 minuten, dan kuolle op iis en centrifuged by 127.000 × g foar 40 minuten.De klearmakke supernatant waard tapast op in 3,5 kDa membraan (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) en dialysearre tsjin 4 L dialysebuffer (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) foar 10 oeren.In 5 ml kation-útwikselkolom (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, Feriene Steaten) waard lykwichtige mei lykwichtbuffer (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).It tau-lysaat waard troch in 0.22 μm PVDF-filter filtere en yn 'e kolom ynjeksje mei in streamsnelheid fan 1 ml / min.Eluaasje waard stadichoan útfierd, tau waard eluearre mei 15-30% elueringsbuffer (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Fraksjes waarden analysearre troch SDS-PAGE, en alle fraksjes dy't ien band befette mei it ferwachte molekulêre gewicht fan tau waarden konsintrearre mei in 10 kDa sintrifugefilter en ferfongen troch in buffer mei 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM en DTT 2 mM foar de definitive proteinkonsintraasje wie 100 μM.De proteïne-oplossing waard doe troch in 0.22 μm PVDF-filter trochjûn, fluch beferzen en opslein by -80 ° C.Protein K18 waard freonlik fersoarge troch prof. Alberto Boffi.De suverens fan 'e tarieding wie> 95% lykas befêstige troch SDS-PAGE en MALDI-TOF/TOF.Ferskate cysteines waarden gemysk markearre mei AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, FS) of TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).waarden befêstige troch absorbance en MALDI-TOF / TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau en K18 waarden markearre mei native cysteine-residuen op posysjes 191 en 322 mei Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Dútslân) nei deselde proseduere.Netto lading per residu kaarten foar αS en Tau441 waarden oanmakke mei CIDER66.
Solid poly-L-lysine (pLK DP 90-110 neffens NMR fan leveransier, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, Feriene Steaten) waard oplost yn 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 oant 10 mM konsintraasje, proses sonicated foar 5 minuten yn in ultrasone wetterbad en bewarje by -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, Feriene Steaten) en FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, Feriene Steaten) binne wetteroplosber en wiidferspraat yn LLPS-buffer.Dialyse ferwideret kontaminearjende sâlten.Se waarden doe filtere troch in syringefilter mei in poargrutte fan 0,22 μm, en har konsintraasjes waarden berekkene mei in refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS-monsters waarden taret by keamertemperatuer yn de folgjende folchoarder: buffer en extrusion waarden mingd en 1 mM tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitril) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) en in mingsel fan 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Dan wurde αS en fusearre polykations (opsjes pLK of Tau) tafoege.Foar thioflavine-T-tiidrige eksperiminten (ThT, Carbosynth, Compton, UK), brûk de totale ThT-konsintraasje om de helte fan 'e αS-konsintraasje te wêzen.Mingje de samples foarsichtich mar yngeand om te soargjen dat se homogeen binne.De konsintraasje fan elke komponint farieare fan eksperimint nei eksperimint, lykas beskreaun yn 'e seksje Resultaten.Azide waard brûkt yn in konsintraasje fan 0,02% (w/v) as de doer fan it eksperimint 4 oeren oersloech.Foar alle analyzes mei LLPS-monsters, lit it mingsel 5 minuten lykwicht meitsje foarôfgeand oan analyse.Foar ljochtferstrooiingsanalyse waarden 150 µl samples laden op net-binende 96-well mikroplaten (µClear®, swart, F-Bottom / Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Eastenryk) en bedekt mei adhesive film.LLP's waarden kontrolearre troch it mjitten fan absorbânsje by 350 nm yn it sintrum fan 'e oplossing yn in CLARIOstar plaatlêzer (BMG Labtech, Ortenberg, Dútslân).De eksperiminten waarden yn trijefâldich útfierd by 25 ° C, en de flaters waarden berekkene as de standertdeviaasje fan 'e gemiddelde.De verdunde faze waard kwantifisearre troch sample-sintrifugaasje en SDS-PAGE-gelanalyse, en de αS-fraksje yn 'e verdunde en konsintrearre fazen waard kwantifisearre yn ferskate LLPS-oplossingen.In 100 μl LLPS-monster mei 1 μM AF488-labele αS waard taret troch yngeand mingen folge troch sintrifugering by 9600 × g foar 30 minuten, wêrnei't it ôffal meastentiids sichtber wie.De top 50 μl fan 'e supernatant waard brûkt foar proteinkwantifikaasje mei SDS-PAGE gel.Gels waarden skansearre mei AF488 filters mei help fan in ChemiDoc gel imaging systeem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) of kleurde mei Coomassie stain en visualisearre mei passende filters.De resultearjende bands waarden analysearre mei ImageJ ferzje 1.53i (National Institutes of Health, USA).De eksperiminten waarden yn duplikaat útfierd yn twa ferskillende eksperiminten mei ferlykbere resultaten.
Typysk waarden 150 μl fan samples tapast op net-binende 96-well mikroplaten en visualisearre by keamertemperatuer op in Leica DMI6000B omkearde mikroskoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Dútslân).Foar spot eksperiminten waarden ek µ-Slide Angiogenesis platen (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Dútslân) of 96-well polystyrene mikroplaten (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) brûkt.EL6000 halogeen of kwik metaal halide lampen waarden brûkt as ferljochting boarnen (foar BF / DIC en WF imaging, respektivelik).Foar WF-mikroskopie waard in loftobjektyf fan 40x fergrutting (Leica Microsystems, Dútslân) brûkt om it ljocht op it probleem te fokusjen en it te sammeljen.Foar AF488 en ThT markearre samples, filter excitation en emisje mei standert GFP filter sets, excitation en emission bandpass filters, respektivelik, 460-500 nm en 512-542 nm bandpass filters, en in 495 nm dichroic spegel.Foar samples bestimpele mei Atto647N, in standert set fan Cy5 filters mei excitation en emisje bandpass filters 628-40 nm en 692-40 nm, respektivelik, en in 660 nm dichroic spegel waarden brûkt.Foar BF- en DIC-mikroskopie brûke itselde objektyf foar reflektearre ljochtsammeling.It sammele ljocht waard opnommen op in Leica DFC7000 CCD-kamera (Leica Microsystems, Dútslân).De eksposysjetiid wie 50 ms foar BF- en DIC-mikroskopie-ôfbylding en 20-100 ms foar WF-mikroskopie-ôfbylding.Foar fergeliking wie de eksposysjetiid foar alle eksperiminten mei ThT 100 ms.Time-lapse-eksperiminten waarden útfierd om dripkoalescinsje te visualisearjen, mei ôfbyldings dy't elke 100 ms foar ferskate minuten sammele wurde.ImageJ (NIH, FS) waard brûkt foar ôfbyldingsanalyse.De eksperiminten waarden útfierd yn triplicate mei ferlykbere resultaten.
Foar colocalization eksperiminten, FRAP en 3D rekonstruksje, bylden waarden oankocht op in Zeiss LSM 880 omkearde konfokale mikroskoop mei help fan in ZEN 2 blauwe edysje (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Dútslân).Samples fan 50 µl waarden tapast op µ-Slide Angiogenesis Petri skûtels (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Dútslân), behannele mei in hydrofiele polymeer (ibiTreat) en monteard yn in 63× oalje immersion objektiv (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) op DIC).Ofbyldings waarden krigen mei 458 nm, 488 nm, en 633 nm argon laserlinen mei in resolúsje fan 0.26 µm / piksel en in eksposysjetiid fan 8 µs / piksel foar eksitaasje- en emissiedeteksjefinsters fan 470–600 nm, 493–628 nm, 493–628 nm. en 638–755 nm waard brûkt om respektivelik ThT, AF488 en Atto647N te visualisearjen.Foar de FRAP-eksperiminten waard time-lapse fotografy fan elke stekproef opnommen op 1 frame per sekonde.De eksperiminten waarden útfierd yn triplicate by keamertemperatuer mei ferlykbere resultaten.Alle ôfbyldings waarden analysearre mei Zen 2 blauwe edysje-software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Dútslân).De FRAP-kurven waarden normalisearre, plot en oanpast oan yntensiteit / tiidgegevens ekstrahearre út ôfbyldings mei Zen 2 mei OriginPro 9.1.De rekreaasjekurven waarden oanpast oan in mono-eksponinsjele model om te rekkenjen mei molekulêre diffusion mei in ekstra eksponinsjele term om te rekkenjen foar it akwisysjebleekeffekt.Wy dan berekkene D mei help fan de nominale bleken radius en de earder fêststeld herstel heal-libben lykas yn 'e fergeliking fan Kang et al.5 35 werjûn.
Single cysteine ​​farianten fan αS waarden synthesized mei 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) op posysjes 24 (TEMPOL-24-αS) en 122 (TEMPOL-122-αS), respektivelik.Spin-labeling Foar EPR-eksperiminten waard de αS-konsintraasje ynsteld op 100 μM en de PEG-konsintraasje wie 15% (w / v).Foar ferskate aggregaasjebetingsten wie de αS: pLK-ferhâlding 1: 10, wylst de αS: ΔNt-Tau en αS: Tau441-ferhâldingen op 1: 1 hâlden waarden.Foar binende titraasje-eksperiminten yn 'e ôfwêzigens fan crowding, waard TEMPOL-122-αS op 50 μM bewarre en polykations waarden titrearre by tanimmende konsintraasjes, it tarieden fan elke betingst apart.CW-EPR-mjittingen waarden útfierd mei in Bruker ELEXSYS E580 X-band spektrometer foarsjoen fan in Bruker ER4118 SPT-N1 resonator dy't operearret op in magnetron (SHF) frekwinsje fan ~9.7 GHz.De temperatuer waard ynsteld op 25 ° C en regele troch in floeibere stikstof kryostaat.De spektra waarden krigen ûnder unsaturated omstannichheden by in MW macht fan 4 mW, in modulaasje amplitude fan 0.1 mT, en in modulaasje frekwinsje fan 100 kHz.Spektrale yntensiteiten waarden normalisearre om ferskillen yn spinkonsintraasjes tusken samples en mooglike spinreduksje te foarkommen fanwegen oerbliuwende konsintraasjes fan ferminderjende aginten yn samples dy't Tau441 of ΔNt-Tau befetsje (oanwêzich yn 'e orizjinele proteïne-oplossings).De opjûne wearden fan g waarden krigen as gefolch fan EPR-spektrale modellering útfierd mei de Easyspin-software (v. 6.0.0-dev.34) ymplementearre yn Matlab®67.Ien / twa komponint isotropyske modellen waarden brûkt om de gegevens te modellearjen.Nei it normalisearjen fan alle sinjalen waarden de residualen berekkene troch elke simulaasje te subtrahearjen fan it oerienkommende eksperimintele spektrum.Foar binende titraasje-analyze waard de relative yntinsiteit fan 'e tredde band nei de twadde band fan it normalisearre EPR-spektrum (IIII / III) brûkt om de bining fan polykations oan αS te kontrolearjen.Om de dissosjaasjekonstante (Kd) te skatten, waard de resultearjende kromme oanpast oan in ungefearde model oannommen fan n identike en ûnôfhinklike binende siden.
NMR-spektroskopy-eksperiminten waarden útfierd mei in Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR-spektrometer útrist mei in kryoprobe en Z-gradient.Alle eksperiminten waarden útfierd mei 130-207 µM αS en oerienkommende αS / ΔNt-Tau en pLK-ekwivalinten yn 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 en waarden útfierd by 15 ° C.Om LPS te kontrolearjen troch NMR, waard 10% PEG tafoege oan de pre-mingde samples.De gemyske ferskowingsfersteuringsplot (figuer 1b) toant de gemiddelde 1H en 15N gemyske ferskowings.De αS 2D1H-15N HSQC-spektra waarden tawiisd op basis fan in eardere opdracht (BMRB-yngong #25227) en befêstige troch it opnimmen en analysearjen fan de 3D-spektra fan HNCA, HNCO en CBCAcoNH.13Cα en 13Cβ gemyske ferskowings waarden berekkene yn 'e oanwêzigens fan ΔNt-Tau of pLK om mooglike feroaringen yn sekundêre struktuertrends te mjitten yn ferliking mei αS gemyske ferskowings yn suver willekeurige spoelkonformaasje 68 (oanfoljende figuer 5c).De R1ρ-tariven waarden mjitten troch it opnimmen fan hsqctretf3gpsi-eksperiminten (ferkrigen fan 'e Bruker-bibleteek) mei fertragingen fan 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 en 800 ms, en de eksponinsjele funksjes waarden oanpast oan 'e peak-yntensiteit kearen om de R1ρ en syn eksperimintele ûnwissichheid te bepalen.
Eksperiminten mei twa-kleur tiid-oplost fluorescence mikroskopy waarden útfierd op in kommersjeel tiid-oplost MT200 fluorescence konfokaal mikroskoop (PicoQuant, Berlyn, Dútslân) mei in tiid-korrelearre ien foton tellen (TCSPC) apparaat.De laser diode kop wurdt brûkt foar pulsed interleaved excitation (PIE), de beam giet troch in inkele modus waveguide en wurdt ôfstimd op in laser macht fan 10 nei 100 nW foar 481 nm en 637 nm laser rigels mjitten nei in dichroic spegel.Dit soarget foar in optimale foton-telfrekwinsje, it foarkommen fan de effekten fan foton-aliasing, fotobleken en sêding.μ-Slide angiogenesis coverslips of platen (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Dútslân) waarden pleatst direkt yn immersion wetter oer in Super Apochromat 60x NA 1.2 lens mei in korrektyf kraach (Olympus Life Sciences, Waltham, Feriene Steaten).In dichroyske spegel fan 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, FS) waard brûkt as haadstraalsplitter.Unfokusearre strieling wurdt blokkearre troch in gat mei in diameter fan 50 mikrons, dan wurdt de rjochte strieling ferdield yn 2 deteksjepaden troch in 50/50 beamsplitter.Bandpass-emisjefilters (Semrock, Lake Forest, IL, Feriene Steaten) 520/35 foar griene kleurstof (AF488) en 690/70 foar reade kleurstof (Atto647N) waarden brûkt foar de detektor.Single-photon avalanche diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Itaalje) waarden brûkt as detectors.Sawol gegevenssammeling as analyse waarden útfierd mei de kommersjeel beskikbere SymphoTime64-software (PicoQuant GmbH, Berlyn, Dútslân).
Fyftich mikroliter LLPS-samples waarden tapast op μ-Slide angiogenesisputten (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Dútslân).De resultearjende ôfbyldings binne rjochte op 20 µm boppe de putboaiem foar optimale objektive wurkôfstân foar ophongen druppels en oant ~ 1 µm foar rafts en punten mei in axiale resolúsje fan op syn minst 0.25 µm / piksel en in fertragingstiid fan 400 µs / piksel.Selektearje gegevens troch it tapassen fan in yntensiteitsdrompel basearre op 'e gemiddelde eftergrûnsinjalintensiteit (PBG, gemiddelde + 2σ) foar elk kanaal, sadat allinich floeibere proteïnedruppels, rafts of spots wurde selektearre, en filtert elke mooglike oarsprong út 'e ferspraat faze.Om de libbensdoer fan elke soart (τ) fan elk kanaal (grien, "g" foar AF488 en read, "r" foar Atto647N, te analysearjen), selekteare wy regio's fan belang (ROI's) mei druppels, rafts of spots (oanfoljende figuer 1) ).8b) en ôflaat se troch it passend harren libben ferfal (τD, τR en τP foar respektivelik drippen, rafts of spots, sjoch Oanfoljende Fig. 8c) yn elk kanaal mei help fan in sturt-fit analyse en in twa-komponint ferfal model.Gemiddelde τ fan τ .ROI's dy't te min fotonen produsearren foar in multy-eksponinsjele fit waarden útsletten fan 'e analyse.De brûkte cutoff wie <104 fotonen foar rafts en stippen en 103 foar drippen.De drippen hawwe in legere drompel om't it dreech is om ferfalskurven te krijen mei hegere yntensiteitswearden, om't de drippen yn it byldfjild meastentiids lytser en minder talich binne.ROI's mei foton-tellingen boppe de limyt foar foton-akkumulaasje (ynsteld op> 500 tellen / piksel) waarden ek ferwidere foar analyse.Kom oerien mei de yntensiteitsferfalskromme krigen fan 'e regio fan belang mei in yntensiteit op 90% fan' e maksimum (in bytsje nei de maksimale yntinsiteit fan 'e ferfal) fan it begjin fan' e tsjinst libben om minimale IRF-ynterferinsje te garandearjen, wylst itselde behâldt foar alle yntensiteitsferfal ynstellings Relative tiid finster Were analysearre 25 oan 50 ROI foar rafts en spots en 15-25 ROI foar drops, ôfbyldings selektearre út mear as 4 replicaten opnommen út op syn minst 3 ûnôfhinklike eksperiminten.Twa-tailed t-tests binne brûkt om statistyske ferskillen tusken soarten of tusken koacervate-systemen te evaluearjen.Foar in piksel-by-piksel analyze fan it libben (τ), de totale attenuation fan it libben oer it fjild foar elk kanaal waard berekkene en in approximation fan in 2/3-komponint eksponinsjele attenuation model waard útfierd.De lifetime attenuation foar elke piksel waard dan oanpast mei help fan earder berekkene τ wearden, resultearret yn in pseudocolor FLIM fit byld.It libbensberik fan tail-fit wie itselde oer alle ôfbyldings fan itselde kanaal, en elke ferfal produsearre genôch fotonen om in betroubere fit te leverjen.Foar FRET-analyze waarden piksels selekteare troch it tapassen fan in legere yntinsiteitsdrompel fan 100 fotonen, dy't in eftergrûnsinjaal (FBG) fan 11 fotonen gemiddelde.De fluorescensintensiteit fan elk kanaal waard korrizjearre troch eksperiminteel bepaalde korreksjefaktoaren: 69 spektrale crosstalk α wie 0.004, direkte eksitaasje β wie 0.0305, deteksje-effisjinsje γ wie 0.517.De FRET-effisjinsje op it pikselnivo wurdt dan berekkene mei de folgjende fergeliking:
wêrby't FDD de fluorescinsje-yntensiteit is waarnommen yn it donor (griene) kanaal, FDA is de fluorescinsje-yntensiteit waarnommen yn it akseptor (read) kanaal ûnder yndirekte excitaasje, en FAA is de fluorescinsje-yntensiteit waarnommen yn it akseptor (read) kanaal ûnder direkte eksitaasje ( TAART).Fluorescence yntinsiteit pulses wurde waarnommen yn it kanaal).
Pleats 100 µl LLPS-reaksje-oplossingen mei 25 µM unlabele monomere Tau441 (mei of sûnder 25 µM αS) yn LLPS-buffer (oanfolle as hjirboppe) op net-binende 96-well-mikroplaten mei adhesive foliecoating en druppelformaasje waard kontrolearre troch WF-mikroskopy lykwicht.binnen 10 min.Nei 48 oeren ynkubaasje by keamertemperatuer waard de oanwêzigens fan proteïneflotten en spots befêstige.Ferwiderje dan de flüssigens foarsichtich oer de platen út 'e boarnen, foegje dan 50 L fan dissosjaasjebuffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) en ynkubearje foar 10 min.De hege sâlt konsintraasje soarget derfoar dat LLPS sil net werhelje fanwege oerbleaune PEG, en mooglike proteïne gearkomsten foarme allinnich troch elektrostatyske ynteraksjes wurde disassembled.De boaiem fan 'e put waard dan foarsichtich ôfskrapt mei in mikropipette tip en de resultearjende oplossing waard oerbrocht nei in lege observaasjeput.Nei inkubaasje fan 'e samples mei 50 μM ThT foar 1 h, waard de oanwêzigens fan isolearre spots kontrolearre troch WF-mikroskopie.Prepare sonicated αS fibrils troch incubating 300 µl fan in 70-µM αS oplossing yn PBS mei pH 7.4, natrium azide 0.01% by 37 ° C en 200 rpm op in orbital shaker foar 7 dagen.De oplossing waard dan 30 min sintrifuge op 9600 × g, de pellet waard resuspendearre yn PBS pH 7.4 en sonicated (1 min, 50% syklus, 80% amplitude yn in Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) fibrilmonsters mei in relatyf unifoarme grutte ferdieling fan lytse fibrillen.
FCS / FCCS-analyze en twa-kleuren oerienkomstdeteksje (TCCD) waarden útfierd op deselde MT200-tiid-oplost fluorescent konfokale mikroskoop (Pico-Quant, Berlyn, Dútslân) brûkt foar de FLIM-FRET mikroskopy-eksperiminten mei de PIE-modus.De laserkrêft foar dizze eksperiminten waard tafoege oan 6.0 µW (481 nm) en 6.2 µW (637 nm).De kombinaasje fan dizze laserkrêften waard keazen om ferlykbere helderheid te produsearjen foar de pearen fan fluorofoaren dy't brûkt wurde by it realisearjen fan optimale telraten en it foarkommen fan fotobleken en sêding.Sawol gegevenssammeling as analyze waarden útfierd mei de kommersjeel beskikbere SymphoTime64 ferzje 2.3 software (PicoQuant, Berlyn, Dútslân).
Samples fan isolearre αS / Tau-aggregaten krigen mei LLPS wurde verdund yn isolaasjebuffer oant de passende monomolekulêre konsintraasje (typysk in 1: 500-verdunning, om't aggregaten al op lege konsintraasjes binne as se isolearre binne fan coacervate-monsters).Samples waarden direkt tapast op coverslips (Corning, FS) foarbeklaaid mei in BSA-oplossing by in konsintraasje fan 1 mg / ml.
Foar de PIE-smFRET-analyze yn 'e griene en reade kanalen waard in legere yntensiteitsdrompel fan 25 fotonen tapast om sinjalen fan lege yntensiteit te filterjen feroarsake troch monomere eveneminten (notysje dat monomeren mear as aggregearre samples binne yn ferliking mei isolearre aggregaten).Dizze drompel waard berekkene as fiif kear de gemiddelde yntinsiteit fan monomere αS krigen út 'e analyze fan suvere monomer-samples om spesifyk aggregaten te selektearjen foar analyse.It PIE-drive-sirkwy, tegearre mei TSCPC-gegevenswinning, hat de tapassing fan in libbensgewichtfilter ynskeakele dy't helpt by it eliminearjen fan eftergrûn en spektrale crosstalk.De flare-yntensiteit selekteare mei de boppesteande drompels waard korrizjearre mei it gemiddelde eftergrûnsinjaal bepaald út 'e histogrammen fan foarkommen tsjin yntinsiteit / bin fan' e puffer-allinich samples.Bursts dy't ferbûn binne mei grutte aggregaten besette typysk ferskate opienfolgjende bakken yn 'e tiidspoar (ynsteld op 1 ms).Yn dizze gefallen waard in bak mei maksimale sterkte keazen.Foar FRET en stoichiometryske analyze waard de teoretysk bepaalde gammafaktor γ (0.517) brûkt.Spektrale crosstalk en direkte excitation bydragen binne negligible (eksperiminteel bepaald) by de excitation laser macht brûkt.De effisjinsje en stoichiometry fan FRET yn in eksploazje wurdt berekkene as folget.