347 roestfrij stiel coiled buizen gemyske komponint, Identifikaasje fan nije interferon-responsive minsklike leukocyte antigeen-A (HLA-A) chaperoneproteinen mei cross-linked massaspektrometrie (CLMS)

Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.
Sliders dy't trije artikels per dia sjen litte.Brûk de efter- en folgjende knoppen om troch de dia's te bewegen, of de slide-controller-knoppen oan 'e ein om troch elke dia te bewegen.

produkt Omskriuwing

Stainless Steel 347L Coil Tubes, Steel Grade: SS347L

It interferon-sinjaalsysteem feroarsaket in sterke cytokine-antwurd op in breed oanbod fan pathogene en yntrinsike patologyske sinjalen út 'e omjouwing, wat resulteart yn' e yndeksje fan subsets fan interferon-inducible proteins.Wy tapasten DSS-bemiddele cross-link massaspektrometry (CLMS) om nije proteïne-proteïne-ynteraksjes te detektearjen yn it domein fan interferon-induzearre proteïnen.Neist de ferwachte interferon-inducible proteïnen identifisearre wy ek nije intermolekulêre en intramolekulêre cross-keppele addukten fan kanonike interferon-inducible proteins lykas MX1, USP18, OAS3, en STAT1.Wy rjochte ús op ortogonale falidaasje fan in nije set fan interferon-inducible protein netwurken foarme troch HLA-A proteins (H2BFS-HLA-A-HMGA1) mei help fan co-immunoprecipitation en harren fierdere stúdzje mei help fan molekulêre dynamyk modeling.Modeling fan 'e konformaasjedynamyk fan it proteïnekompleks iepenbiere ferskate ynteraksje-sites dy't de ynteraksjes wjerspegelje dy't identifisearre binne yn' e CLMS-befinings.Tegearre presintearje wy in pilotstúdzje fan CLMS om nije sinjaalkompleksen te identifisearjen dy't feroarsake binne troch interferon, en sjogge út nei it bredere gebrûk fan CLMS om nije dynamyk fan proteïne-ynteraksjes te identifisearjen yn 'e tumormikro-omjouwing.
Foardat in adaptive ymmúnreaksje begjint, monteart it oanberne ferdigeningssysteem fan 'e gasthear in antimikrobiële reaksje op bemiddele troch in famylje fan sekreteare alfa-helikale cytokines neamd interferons (IFN's).De type I IFN-klassen IFNα en IFNβ aktivearje sellulêre antwurden, ynklusyf antivirale, proapoptotyske, proinflammatory en antiproliferative steaten.By minsken binne 13 subtypen fan IFNα bekend, allegear klustere op chromosoom 91. Ferrassend is allinich IFNα2 studearre foar klinysk gebrûk.De lêste tiid is spesjaal omtinken jûn oan ûndersyk nei oare subtypen fan IFNα.In resinte stúdzje liet sjen dat IFNα14 ien fan 'e meast effektive isofoarmen is yn it beheinen fan HBV2- en HIV-13,4-replikaasje yn ferliking mei it kanonike IFNα2-subtype.
It is fêststeld dat aktivearre type I interferon-receptorkompleksen (IFNAR1 en IFNAR2) in sinjaaltransduksjekaskade útlizze bemiddele troch Janus-kinasen TYK2 en JAK15,6.Dizze Janus kinases phosphorylate sinjaaltransducers en transkripsjonele proteïneaktivators (STAT1 en STAT2) op tyrosine-residuen om SH2-domein-mediated heterodimerization6 te begjinnen.Ferfolgens bindet IRF9 STAT-heterodimeren om in trimearysk kompleks te foarmjen fan it IFN-stimulearre faktor 3-gen (ISGF3), dat translokearret nei de kearn en induceart de transkripsje fan mear dan 2000 interferon-stimulearre genen (ISG's) 5,6,7,8.
ISG's foarmje de rêchbonke fan it oanberne ymmúnsysteem, benammen yn reaksje op virale oanfal.As earste line fan definsje tsjin virale ynfeksje, ynsette sellen rap wiidweidige ynteraksjes fan sellulêre aaiwiten mei in breed oanbod fan biologyske aktiviteiten.Dizze aaiwiten omfetsje patroanherkenningsreceptors, sinjaalmolekulen, transkripsjefaktoaren, en aaiwiten mei direkte antivirale funksjes, lykas negative regulators fan ymmúnreaksjes9.In protte fan 'e ynformaasje oer ISG-aktiviteit komt fan funksjonele skermen dy't gebrûk meitsje fan oerekspresje-skermen10,11 of gen-silencing-techniken (siRNA, RNAi en CRISPR)12,13 wêryn yndividuele ISG's wurde útdrukt of ynhibeare en har aktiviteit wurdt hifke op ferskate firussen.Hoewol dizze stúdzjes de antivirale eigenskippen fan yndividuele ISG's hawwe bepaald, bliuwe de ûnderlizzende molekulêre meganismen fan elke ISG foar in grut part ûnbekend.It wurdt algemien akseptearre dat in protte proteïnen ynteraksje mei ien of mear cytokines om folsleine aktiviteit te garandearjen, sadat ISG's direkt ynteraksje as har ynteraksjes wurde bemiddele troch sellulêre proteïnen.Bygelyks, in resinte photocrosslinked proteomics-stúdzje identifisearre ATPase VCP / p97 as in wichtige IFITM3-ynteraksjepartner, waans ynhibysje liedt ta defekten yn lysosomale sortearring, omset en kotransport fan IFITM3 mei virale dieltsjes 14 .Mei help fan immunoprecipitaasje identifisearren wy VAPA, in vesicle-assosjearre proteïne, as in ynteraksjepartner mei IFITM1/2/3 dy't cholesterol-bemiddele virale maturaasje bemiddelet, en dit waard befêstige troch in oare stúdzje mei in gist twa-hybride systeem.Wittenskiplike stipe 15, 16.
In fûnemintele biologyske proses belutsen by de ûnderdrukking fan ynfeksje en maligne transformaasje is antigeenpresintaasje, dy't wurdt bemiddele troch grutte histokompatibiliteitskompleks (MHC) molekulen.Peptiden (8-12 aminosoeren lang) fan ôfsplitste, foartiid beëinige of misfolde proteïnen wurde laden yn 'e MHC-I heterodimer (besteande út MHC-I swiere en lichte keatlingen, neamd β-2-microglobulin; β2M) 17,18.De resultearjende stabile MHC-I trimers wurde ferfierd nei it sel oerflak, dêr't se presintearje intracellular peptiden oan CD8+ T-sellen (cytotoxic T-sellen)17.T-sellen werkenne en ferneatigje dizze patogenen en sellen dy't in tumor-spesifike antigeen drage.Dêrtroch ûnderdrukke patogenen en tumorsellen faak it antigeenpresintaasjeproses om ymmúntafersjoch te foarkommen.Derneist wurdt MHC-I downregulearre yn 40-90% fan minsklike tumors en wurdt faak assosjearre mei in earmere prognoaze19.
Genen belutsen by it reagearjen op patogenen moatte fluch wikselje tusken in steat fan rêst en in steat fan aktive transkripsje.Dêrom wurde ferskate sellulêre proteïnen hypoteze belutsen by it antwurd op hege IFN-fraach oer koarte perioaden, ynklusyf ferbouwing en modifikaasje fan promotorchromatine 20,21.De measte stúdzjes hawwe rjochte op de identifikaasje fan yndividuele ISG-proteinpartners yn 'e oanwêzigens fan IFN.Ferskate proteomyske en transkriptomyske stúdzjes yn modelselsystemen hawwe it effekt fan IFN op it sellulêre lânskip ferljochte.Nettsjinsteande in tanimmend begryp fan 'e dynamyk dy't feroarsake wurdt troch interferonen, witte wy noch net folle oer de belutsenens fan ISG's.By it beskôgjen fan de kompleksiteit en tiid-ôfhinklike dynamyk fan interferon-sinjalearring, ûntsteane twa fragen: (i) is it mooglik om de multiproteinkompleksen te stabilisearjen en te fangen dy't belutsen binne by rappe sinjalearring, en (ii) kinne dizze ynteraksjes yn kaart brocht wurde yn 3D-romte?
Om dizze problemen oan te pakken, ymplementeare wy disuccinimide suberate-bemiddele gemyske cross-linking (DSS) keppele mei massaspektrometry (CLMS) om it IFNα-induzearre proteïne-ynteraksjenetwurk en syn dynamyk te studearjen.DSS foeget kovalente bannen ta tusken proximale resten fan aaiwiten en/of proteïnekompleksen yn vivo.Folgjende MS-analyze lit spesifike crosslinking-siden sjen dy't de romtlike tichtby fan regio's binnen in bepaald proteïne reflektearje, ynterne keppelings neamd, of subunits yn proteinkompleksen, neamd ynterrelaasjes.Mei dizze oanpak hawwe wy ferskate nije proteïne-proteïne-kompleksen identifisearre, lykas interferon-induzearre multiprotein-ynteraksjenetwurken.Troch fierder te testen in subset fan dizze nije ynteraksjes, litte wy sjen dat H2BFS (H2B histon-type FS; hjirnei oantsjutten as H2B) en MDN1 fungearje as binende partners foar HLA-A.
Flo-1-sellen binne ien fan 'e bekendste in vitro-modellen fan esophageal adenocarcinoma, om't se wichtige skaaimerken fan' e esophageale tumors mimike22,23.Net alle tumors binne lykwols immunogenysk, en om te bepalen as Flo-1-sellen reagearje op interferon-behanneling, hawwe wy Flo-1-sellen behannele mei 10 ng / ml IFNα foar 72 oeren.Flo-1-sellen lieten frjemde yndeksje fan pSTAT1 en IRF1 sjen, begjinnend 2 oeren nei behanneling en trochgean foar 72 oeren, mei in tiidôfhinklike ôfnimming fan stasjonêre nivo's fan IRF1 (figuer 1A).ISG's (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, en ISG15) waarden nei 6 oeren sterk oanwiisd, en mimike de klassike mid- en lette faze-antwurden op IFNα (figuer 1A).Mei-elkoar suggerearje dizze gegevens dat dit sellulêre model kin wurde brûkt om interferon-antwurden te studearjen.
Differinsjaal proteïne-ekspresje-antwurden yn Flo-1-sellen nei IFNα-behanneling.(A) Protein-ekspresje yn Flo-1-sellen behannele mei 10 ng / ml IFNα foar 2, 6, 24, 48 en 72 oeren waard analysearre troch immunoblot mei de oantsjutte ISG-antylders.(B) Coomassie blauwe kleurde SDS-PAGE-gels fan folsleine sel-ekstrakten nei cross-linking mei DSS foar oantsjutte tiden en konsintraasjes.(C) Fertsjintwurdiger immunoblot ûndersocht mei p53 (DO-1) antykodyk út deselde samples om de mjitte fan proteïne cross-linking te beoardieljen.
Om it lânskip fan in situ proteïne-ynteraksje te fangen, brûkten wy DSS, in breed brûkte cross-linking-agent fanwege syn hege membraanpermeabiliteit en relatyf koarte reaksjetiid.De koartere reaksjetiid helpt om de formaasje fan grutte aggregaten fan crosslinked aaiwiten te foarkommen, en behâldt dêrmei de stabiliteit fan 'e crosslinker.Om de optimale DSS-konsintraasje te bepalen en oer-crosslinking te foarkommen, hawwe wy de sellen earst bleatsteld oan 5, 2.5, en 1 mM DSS foar respektivelik 5, 10, 5 en 30 minuten, en analysearren de lysaten troch Coomassie-bekleurde SDS-PAGE (gegevens net werjûn).Sellysaten lykje tige cross-keppele te wêzen op 'e leechste konsintraasje en op it koartste tiidpunt.Dêrom waard DSS titrearre nei 1, 0.5, en 0.1 mM oer 5 minuten (figuer 1B).Optimale crosslinking waard waarnommen mei 0.5 mM DSS foar 5 minuten, en dizze betingsten waarden keazen foar sellen behannele mei IFNα.Derneist toant figuer 1C in westerske blot útfierd mei it p53 (DO-1) antykodym om de mjitte fan proteïne cross-linking te beoardieljen.
Flo-1 sellen waarden behannele mei 10 ng / ml IFNα foar 24 oeren foardat it tafoegjen fan de crosslinker.Cross-linked sellen waarden dêrnei lysed troch twa-stap proteolysis en aaiwiten waarden ferwurke troch FASP (Fig. 2) 24,25.Cross-keppele tryptyske peptiden waarden analysearre troch massaspektrometry (figuer 2).De MS / MS-spektra wurde dan oanpast oan 'e proteïnesekwinsje en kwantifisearre mei MaxQuant26,27.Cross-keppele peptiden waarden identifisearre fan 'e krigen spektra mei it SIM-XL-programma, en yndividuele ferbiningen waarden kombineare yn in komplekse netwurk mei de xQuest28 en SIM-XL29 iepen boarne komputersoftware pipelines (Fig. 2).SIM-XL identifisearret proteïne-proteïne-ynteraksjes, ynterne keatlingen en yndividuele keatlingen yn ienfâldige as komplekse proteïngemiksen en leveret skripts foar it visualisearjen fan ynteraksjes yn proteïnestruktueren.Derneist rangearret it elke krúsferwizing as in ID-score neffens de MS / MS29-spektrumkwaliteit.Ferskate tige betroubere proteïne-protein-ynteraksjes en kompleksen binne identifisearre, en in nije set fan ynteraksjes is fierder ûndersocht mei help fan ko-immunoprecipitaasje en konformaasjewizigingen fan kompleksen mei molekulêre dynamyk (MD) modeling (Fig. 2) 30, 31.
Skematysk oersjoch fan 'e CLMS-metoade.Flo-1 sellen waarden behannele mei 10 ng / ml IFNα foar 24 oeren folge troch in situ proteïne cross-linking mei DSS folge troch sellysis en trypsinisaasje.Cross-keppele samples waarden analysearre mei in Orbitrap massaspektrometer en fierder sampled foar fragmintaasje fan peptide foarrinners tidens LC-MS / MS.Twa keppele peptiden waarden identifisearre út de krigen spektra mei help fan de Spectrum Recognition Machine fan it Crosslinked Peptides (SIM-XL) programma, en alle ferbiningen waarden kombinearre yn in kompleks netwurk mei help fan computational pipelines.Filterje lege fertrouwen ynteraksjes basearre op falske positive taryf (FDR) skoares.Ferskate nije hege-fidelity protein-protein ynteraksjes waarden fierder befêstige mei help fan co-immunoprecipitation, en conformational feroarings yn de kompleksen waarden ûndersocht mei help fan molekulêre dynamyk (MD) modeling.
In totaal fan ~ 30.500 en ~ 28.500 peptiden waarden ûntdutsen mei MaxQuant yn respektivelik unstimulearre en stimulearre IFNα-samples (oanfoljende tabel S1, Fig. 3A).De peptide lingte ferdieling yn beide gefallen toande in hegere oanpart fan gruttere peptiden, wat oanjout de oanwêzigens fan cross-keppele peptiden (Fig. 3B, C).Dêrnjonken wiene in grutter part fan gruttere peptiden oanwêzich yn it 40-55-berik yn IFNα-behannele samples (Fig. 3C).Proteinmapping tsjin log2-yntensiteit liet sjen dat klassike interferon-stimulearre aaiwiten de meast oerfloedich wiene yn ferliking mei net behannele samples, ynklusyf MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, en HLA-F (figuer 3D).Analyse fan paden foar proteïnen mear as trije kear ferrike yn reaksje op IFNα-behanneling mei de Reactome-paaddatabase liet sjen dat MHC-I-bemiddele antigeenpresintaasje en ferwurking de meast dominante paad wie (figuer 3E).Yn oerienstimming mei eardere rapporten wiene antivirale antwurden bemiddele troch OAS en ISG15, lykas IFNα / β en cytokine-sinjalearring ûnder de aktivearre paden.Dêrnjonken waarden lysine- en serine-spesifike proteïne cross-links identifisearre fan 'e oarspronklik oankochte MS / MS-spektra mei SIM-XL.In resinte stúdzje rapportearre 104 ISG's dy't 20 firussen út 9 firusklassen spanne troch meta-analyze fan yndividuele ISG-overekspresjestúdzjes yn 5 seltypen9.Om lykwols de komputaasjebeheiningen fan it screenen fan grutte datasets te oerwinnen, begûnen wy mei in lytsere dataset om mooglike ynteraksjes te ûndersykjen tusken de list fan IRDS-genen rapporteare troch Padaria et al., wêrfan de measte ISG's binne.
Identifikaasje fan differinsjaal útdrukt cross-keppele aaiwiten yn reaksje op IFNα (gegevens krigen fan MaxQuant).(A) Venn-diagram fertsjintwurdiget it oantal mienskiplike en eksklusive peptiden identifisearre yn IFNα14-behannele en net-behannele Flo-1-samples.Peptide lingte ferdieling fan net behannele (B) en IFNα behannele (C) crosslinked samples.(D) Heatkaart dy't log2 (LFQ-yntensiteit) fertsjintwurdiget tusken net behannele en IFNα14-behannele Flo-1-sellen.It linker paniel toant de aaiwiten meast aktyf aktivearre yn 'e oanwêzigens fan IFNα.(E) Histogram fertsjintwurdiget de 20 wichtige ferrikingspaden nei IFNα-behanneling.De Reactome-paaddatabank analysearre mear dan fjouwer kear feroaringen yn upregulearre IFNα-responsive proteins.
Interferon-bemiddele ISG-stimulaasje is goed dokumintearre, mar op it molekulêre nivo is it min begrepen hoe't dizze aaiwiten kulminearje yn in breed oanbod fan biologyske funksjes.Wy ûndersochten proteïne-ynteraksjes mei in hege graad fan fertrouwen tusken bekende ISG's.Ynteressant hawwe wy in netwurk identifisearre ynklusyf MX1, USP18, ROBO1, OAS3, en STAT1-proteinen dy't in grut kompleks foarmje yn antwurd op IFNα-behanneling (figuer 4, Tabel S2) 32,33,34.It wichtichste binne dizze ynteraksjes fûn yn alle triplicates behannele mei IFNα en waarden net fûn yn unbehannele samples, wat suggerearret dat se spesifyk foarme waarden yn antwurd op IFNα-behanneling.It is bekend dat STAT1 transkriptioneel de ekspresje fan dizze ISG's regulearret, mar har ynteraksje mei ISG's op it proteinnivo is net studearre.De kristalstruktuer fan STAT1 liet sjen dat har helical domein (CCD) net belutsen is by de ynteraksje mei DNA of protomers by de formaasje fan dimers35.Dizze α-helices foarmje in spiraalfoarmige helixstruktuer dy't in foaral hydrofiele oerflak biedt foar ynteraksjes om 35 foar te kommen.Yn ús CLMS-gegevens observearren wy dat de measte ynteraksjes mei STAT1 barde yn it SH2-domein foarôfgeand oan de CCD, it linkerdomein, of de C-terminale sturt (residuen 700-708) (figuer 4A).In eardere stúdzje rapportearre dat USP18 bindet oan it CCD en DNA-ferbinende domein (DBD) fan STAT2 en wurdt rekrutearre oan 'e subunit fan' e type I interferon-receptor IFNAR2 om ynhibysje fan type I-interferon-sinjalearjen 24 te mediatearjen.Us gegevens lieten ek sjen dat it katalytyske domein USP18 ynteraksje mei STAT1 DBD (figuer 4A, D), wat suggerearret dat sawol STAT1 as STAT2 in rol spylje kinne by it oanlûken fan USP18 nei IFNAR2.
Protein-protein ISG netwurk identifisearre yn cross-linked sellen behannele mei IFNα.(A) 2D-ynteraksjeplot dy't proteïne-proteïne-ynteraksjes toant (generearre yn it SIM-XL-programma), mei rigels dy't intermolekulêre ynteraksjes fertsjintwurdigje (crosslink cutoff ynsteld op 3.5).Domeinen fan ferskate identiteiten wurde markearre troch har kleur32: MX1-domein, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547), en GED (569-660).OAS3-domeinen: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), en OAS1_C (903-108).Domein ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678-758) en fn3 (777-864).STAT1-fjilden: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), en STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Circular viewer fan cross-linked proteins (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, en STAT1) mei ynteraksjes en ynteraksjes markearre yn blau en read, respektivelik.De cross-link drompel waard ynsteld op 3.5.Dot-plots jouwe STAT1-ynteraksjesites oan mei MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), en OAS3 (F), lykas ek K- as S-ynteraksje-sites tusken de twa peptiden.Yn 'e figuer is de drompel foar cross-linkscore ynsteld op 3.0.(G) Ferskate ynteraksjesites tusken STAT1- en OAS3 DI-domeinen dy't op har proteïnestruktueren yn PyMol (PyMOL molekulêr grafysk systeem, ferzje 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) en OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programma.
Twa isofoarmen fan USP18 binne beskreaun yn 'e minsken, in folsleine proteïne dat foaral yn' e kearn leit, en in isofoarm sûnder in N-terminal domein, USP18-sf, dy't evenredich ferdield is yn 'e cytoplasma en kearn 36 .Dêrnjonken waard de N-terminus foarsein om unstrukturearre te wêzen en hat gjin isopeptidase-aktiviteit of ISG1537-bining nedich.De measte fan 'e ynteraksjes identifisearre yn ús stúdzje wiene lizzend oan' e N-terminus fan 'e proteïne, wat suggerearret dat dizze ynteraksjes USP18 (figuer 4A, D) yn folsleine lingte belûke en dus wierskynlik foarkomme yn' e kearn.Boppedat jouwe ús gegevens ek oan dat de N-terminus spesjalisearre is foar proteïne-nei-proteïne-ynteraksjes.De IFNAR2-binende side leit tusken residuen 312-368, en benammen gjin fan 'e aaiwiten yn it kompleks bine oan dizze regio (Fig. 4A) 37,38.Dizze gegevens tegearre nommen jouwe oan dat it IFNAR2-binende domein allinich brûkt wurdt troch it receptorprotein.Dêrnjonken waarden allinich OAS3 en ROBO1 fûn te wêzen ferbûn mei domeinen streamop fan 'e N-terminus en IFNAR2 binende side (figuer 4A).
ROBO1 heart ta de immunoglobulin (Ig) superfamylje fan transmembrane sinjaalmolekulen en bestiet út fiif Ig-domeinen en trije fibronectin (Fn)-domeinen yn 'e ekstrazellulêre regio.Dizze ekstrazellulêre domeinen wurde folge troch in membraan-proximale regio en in inkele transmembrane helix 39. In unstrukturearre yntrazellulêre regio leit oan 'e C-terminus en befettet bewarre sekwinsjemotiven dy't effektorproteinbinding bemiddelje39.De regio dy't útwreidet fan aminosoeren ~ 1100 oant 1600 is meast ûnregelmjittich.Wy fûnen dat MX1 ynteraksje mei ROBO1 fia Ig, Fn, en intracellular domeinen, wylst de measte ynteraksjes mei STAT1 foarkomme tusken syn CCD, linker domein, en de C-terminus fan ROBO1 (Fig. 4A, E).Oan 'e oare kant waarden ynteraksjes mei DI-, DIII- en OAS3-linkerregio's ferspraat oer it ROBO1-protein (fig. 4A).
De oligoadenylate synthase (OAS) proteïnefamylje akseptearret en bindet intrazellulêre dûbele strâne RNA (dsRNA), ûndergiet konformaasjewizigingen, en syntetisearret 2',5'-keppele oligoadenylates (2-5 As) 40 .It waard fûn dat ûnder de trije OAS's, OAS3 de heechste affiniteit foar dsRNA toant en synthesizes it minste bedrach fan 2-5 As, dy't RNase L aktivearje kin en dêrmei virale replikaasje 41 beheine.De famylje OAS bestiet út polymerase beta (pol-β)-like nukleotide transferase domeinen.Earder ûndersyk hat oantoand dat de katalytyske aktiviteit fan it C-terminale domein (DIII) ôfhinklik is fan it dsRNA-binende domein (DI), dat nedich is foar de aktivearring fan OAS342.Wy observearre dat de DI- en DII-domeinen fan OAS3 ynteraksje mei CCD en in lyts knooppuntregio tusken SH2 en STAT1 TAD (figuer 4A, F).It oerlizzen fan ferskate crosslinkingsplakken op 'e proteinstruktuer liet in ynteraksje sjen tusken it β-blêd en DBD STAT1-loop en in iepen pocket of holte foarme troch residuen 60-75 yn it DI-domein fan OAS3 (Fig. 4G).De oriïntaasje fan 'e aaiwiten yn it kompleks joech ek oan dat gjin fan' e ynteraksjes mei OAS3 bemuoide mei de DNA-ferbinende fermogen fan har DI-domein (fig. S1A).Dêrnjonken ynteraktearret it N-terminale domein fan GTPase MX1 wiidweidich mei de DI- en DIII-domeinen fan OAS3 (Fig. 4A).Wy observearre ek in ynteraksje tusken OAS1 en MX1 yn alle trije IFNα-behannele werhellingen, wêrby't in inkeld OAS1-domein (ek katalytysk aktyf) ynteraksje mei alle trije MX1-domeinen (figuer S2A, B).
MX-proteïnen meitsje diel út fan in grutte famylje fan dynein-like GTPases dy't in N-terminal GTPase-domein befetsje dy't GTP bynt en hydrolyseart, in tuskendomein dat sels-assemblage bemiddelet, en in C-terminal leucine-rits dy't fungearret as in GTPase (LZ) ).domein effektor domein25,43.MX1 bindet oan subunits fan virale polymerases om transkripsje fan it virale gen43 te blokkearjen.In earder rapporteare gist twa-hybride skerm liet sjen dat PIAS1-assosjearre MX1 STAT1-bemiddele genaktivearring ynhibeart troch DNA-binende aktiviteit te blokkearjen en ek SUMO E344,45-ligaseaktiviteit hat.Hjir litte wy sjen dat MX1 bynt oan STAT1 (figuer 4C, D), lykwols hoe't dizze ynteraksje ynfloed hat op STAT1-bemiddele geneaktivearring yn antwurd op IFNα moat fierdere stúdzje.Dêrnjonken fûnen wy ek dat MX1 ynteraksje mei IFIT3 en DDX60 yn alle trije IFNα-behannele werhellingen (Fig. S2C).
DDX60 is in IFN-induzearre cytoplasmyske helicase dy't earder rapportearre is om in rol te spyljen yn RIG-I-ûnôfhinklike degradaasje fan virale RNA46.It interacts mei RIG-I en aktivearret syn sinjalearring yn in ligand-spesifike wize 46. DDX60 bestiet út in DEXD / H-Box helicase domein en in C-terminal helicase domein dat bine virale RNA en DNA47.De measte fan syn ynteraksjes mei MX1 en IFIT3 komme binnen lange N- en C-terminal regio sûnder kanonike domeinen of motiven (figuer S2E, F).Lykwols, MX1 is ek assosjearre mei de DEXD / H-Box helicase domein (Fig. S2E).Proteins fan 'e IFIT-famylje hawwe tandemkopyen fan in ûnderskiedend helix-turn-helix-motyf neamd de tetrapeptide repeat (TPR).IFIT3 waard fûn in positive modulator te wêzen fan RIG-I-sinjalearjen en dêrmei in komponint fan it MAVS-kompleks.Mei-inoar suggerearje ús gegevens dat IFIT3 en DDX60 primêr ynteraksje yn 'e regio tusken TPR 3-6 fan IFIT3 en kinne in rol spylje yn RIG-I / MAVS-sinjalearring (Fig. S2F).
Sjoen dat it screenen fan it heule proteoom berekkeningsintensyf is, hawwe wy dan de heule minsklike UniProt-databank screened foar de oanwêzigens fan ien fan 'e IFNα-behannele werhellingen.Yn dizze replika fûnen wy ferskate heul betroubere ynteraksjenetwurken foar HLA-A.Analyse fan proteïnepaden identifisearre troch MS / MS-spektra lieten sjen dat MHC-I-basearre antigeenferwurking en presintaasje de wichtichste paad is dy't troch interferon feroarsake wurdt (fig. 3D).Dêrom rjochte wy ús op it bestudearjen fan de proteïne-ynteraksjes fan MHC-I-molekulen mei in hege graad fan fertrouwen yn alle cross-keppele samples.HLA bestiet út α1, α2 en α3 domeinen en lichte keatlingen, en mikroglobulin β2 (β2m) is in konstant chaperoneprotein49.Ienris gearstald yn it endoplasmyske retikulum, is HLA ynstabyl by it ûntbrekken fan peptide-liganden50.De peptide-binende groove wurdt foarme troch de tige polymorphic en unstructured α1 en α2 domeinen yn net-peptide foarm en de relatyf minder polymorphic α351 domein.Yn 'e oanwêzigens fan IFNα ûntdutsen wy twa HLA-A-kompleksen: ien ynteraksje mei HMGA1 en H2B (figuer 5, Tabel S3) en de oare ynteraksje mei MDN1, LRCH4 en H2B (figuer 6).
IFNα induces in HLA-A ynteraksje netwurk mei H2B (H2BFS) en HMGA1.(A) 2D plot (generearre yn SIM-XL software) ôfbyldzjen fan ferskate soarten ynteraksjes yn de H2B-HLA-A-HMGA1 kompleks: interlink (blau), interlink (read) en inkele keppeling (swart)..Domeinen fan ferskillende identiteiten binne kleurkodearre32: H2B (histone; 2-102) en MHC-I (MHC_1; 25-203, groep C1; 210-290 en MHC_I_C; 337-364).De cross-link drompel waard ynsteld op 3.5.Dot plots jouwe HLA-A ynteraksje sites mei H2B (B) en HMGA1 (C), likegoed as K of S ynteraksje sites tusken de twa peptiden.Yn 'e figuer is de drompel foar cross-linkscore ynsteld op 3.0.(D) Relaasjes tusken proteïnen werjûn yn 'e struktueren fan' e H2B, HLA-A, en HMGA1 proteïnen yn it PyMOL-programma.Dizze struktueren waarden modeleare mei de Phyre2-tsjinner (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) en de sjabloanstruktueren foar de H2B-, HLA-A- en HMGA1-proteinen wiene respektivelik 1kx552, 1kj349 en 2eze55.
IFNα induces in HLA-A ynteraksje netwurk mei H2B (H2BFS), MDN1 en LRCH4.(A) Intramolecular (read) en intermolecular (blau) crosslinks presintearre op in 2D ynteraktive kaart (generearre yn SIM-XL software) mei MDN1 fertsjintwurdige as in sirkel.De cross-link drompel waard ynsteld op 3.5.Domeinen fan ferskillende identiteiten binne kleurkodearre32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, groep C1; 210–290 en MHC_I_C; 337–364) en LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) en CH (535-641)).(B) Relaasjes tusken proteïnen werjûn yn 'e struktueren fan' e H2B, HLA-A, LRCH4, en MDN1-proteinen yn it PyMOL-programma.Dizze struktueren waarden modeleare mei de Phyre2-tsjinner (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) mei sjabloanstruktueren 1kx552, 1kj349, 6hlu62 en 6i2665 foar de H2B, HLA-A, LRCH4 en MDN1 aaiwiten, respektivelik.Dot plots sjen litte K of S ynteraksje sites foar HLA-A mei H2B (C), LRCH4 (D), en MDN1 (E).Foar plots waard de cross-link-score-drompel ynsteld op 3.0.
Njonken it behâld fan de yntegriteit fan it genom, is histon H2B ek belutsen by de regeling fan transkripsje.It H2B-protein bestiet út in sintraal histone-domein (HFD) foarme troch trije α-helices skieden troch loops en in C-terminale sturt 41,52.De measte fan 'e ynteraksje mei H2B komt foar yn' e α1-helix, dy't trimerisaasje leveret mei de HFD-heterodimer (Fig. 5A,B).Hoewol lysinen binne belutsen by DNA-bining, binne guon lysinen ek alternative acetylaasje- of methylaasjeplakken.Bygelyks, residuen K43, K46 en K57 fan H2B binne net belutsen by direkte DNA-bining, mar binne doelen fan ferskate post-transkripsjonele modifikaasjes53.Likegoed kinne resten K44, K47 en K57 yn H2B in alternative rol spylje yn 'e oanwêzigens fan IFNα, ynklusyf ynteraksjes mei oare aaiwiten (Fig. 5A, B).Derneist aktivearret it ekstrachromosomale histone H2B de ymmúnreaksje yn ferskate seltypen, fungearret as in cytosolyske sensor om dûbelstrengige DNA (dsDNA) fragminten te detektearjen dy't ôflaat binne fan ynfeksjeare aginten of skansearre sellen54.Yn 'e oanwêzigens fan DNA-firussen ynhibearre H2B-útputting IFN-β-produksje en STAT154-fosforylaasje.H2B is ek bekend om yn en út 'e kearn flugger te bewegen as oare kearnhistonen54.H2B-ynteraksjes mei MDN1 en LRCH4 waarden ek beoardiele yn selekteare net behannele samples.Wy fûnen dat HLA-A ynteraksje mei H2B yn alle trije IFNα-behannele samples en yn ien net behannele werhellingsmonster.Dizze gegevens wjerspegelje de rol fan H2B yn in alternative fysiologyske funksje ûnôfhinklik fan transkripsjonele regeling.
HMGA1 (hege mobiliteitsgroep AT-Hook 1), in lyts nukleoprotein ryk oan sykte-befoarderjende aminosoeren, is identifisearre yn assosjaasje mei HLA-A.It hat in soere C-terminale sturt en trije ûnderskate DBD's neamd AT-haken, om't se bine oan 'e lytse groove fan' e AT-rike regio yn dsDNA55,56.Dizze bining soarget foar it bûgen of rjochtsjen fan it DNA, wêrtroch kanonike transkripsjefaktoaren tagong krije ta syn konsensussekwinsje.De C-terminale sturt wurdt leaud belutsen te wêzen by proteïne-proteïne-ynteraksjes en de werving fan transkripsjefaktoaren, om't C-terminale deletion-mutanten net yn steat binne om transkripsje te begjinnen57.Boppedat befettet dit domein ferskate bewarre phosphorylaasjeplakken dy't bekende substraten binne foar kinasen 58.Wy observearre HLA-A- en H2B-ynteraksjes mei HMGA1 bûten it C-terminale domein, wat suggerearret dat it C-terminale domein benammen brûkt wurdt foar transkripsjefaktorbinding (Fig. 5A, C).HMGA-proteïnen konkurrearje mei histon H1 foar bining oan adapter-DNA, wêrtroch de tagonklikens tanimme57.Lykas liket it wierskynlik dat HMGA ynteraksje mei histon H2B lâns de linker DNA yn konkurrinsje mei histon H1.HMGB1 feroarsaket de ekspresje fan HLA-A, -B, en -C yn dendrityske sellen, wat liedt ta har aktivearring59, mar in ynteraksje tusken HMG en HLA is net earder rapportearre.Wy fûnen dat HMGA1 ynteraksje mei de α1- en α3-domeinen fan HLA-A, mei de measte ynteraksjes bûten syn 3 DBD (figuer 5A, C).Yn ús hannen waard HLA-A fûn yn 'e kearn te pleatsen (gegevens net werjûn), en jûn dat H2B en HMGA1 ek oanwêzich binne yn' e kearn, komt dizze ynteraksje wierskynlik yn 'e kearn foar.Spesifike addukten mjitten tusken H2B, HLA-A, en HMGA1 wurde werjûn yn figuer 5D.
De measte ynteraksjes fan HLA-A mei oare aaiwiten bart binnen syn α1 en α2 domeinen en de ûnregelmjittige C-terminal domein (figuer 6).Yn ien fan dizze foarbylden fûnen wy dat HLA-A ynteraksje mei de ûnregelmjittige N-terminale sturt fan LRCH4 (figuer 6A, D).LRCH4 regulearret TLR4-aktivearring en LPS-cytokine-ynduksje, en modulearret dêrmei de oanberne ymmúnreaksje60,61.It is in membraanprotein mei njoggen leucine-rike werhellingen (LRR's) en in calmodulin (CH) homology motyf yn syn ektodomein, folge troch in transmembrane domein (TMD) 60, 62.CH-domeinen binne rapportearre om proteïne-protein-ynteraksjes 60 te mediatearjen.In stik fan sa'n 300 aminosoeren tusken de LRR- en CH-domeinen is relatyf tagonklik, mar ûnregelmjittich.Op grûn fan 'e funksje fan ûnrêstige regio's as mediators fan proteïne-protein-netwurken en vesikulêre ferfier 63, fûnen wy dat de measte proteïne-ynteraksjes foarkomme yn ûnrêstige regio's.Ynteraksjes mei MDN1 waarden ferdield oer de lingte fan it proteïne, ynklusyf de LRR1, LRR6, CH-domeinen en willekeurige regio's, wylst H2B benammen bûn oan it CH-domein (Fig. 6A, B).Opmerklik omfette gjin fan 'e ynteraksjes de TMJ, wat de spesifisiteit fan' e CLMS-oanpak suggerearret (figuer 6A, B).
MDN1 is ek identifisearre as diel fan it HLA-A-proteinnetwurk (figuer 6A).It heart ta de AAA-famylje fan aaiwiten (ATPases ferbûn mei ferskate aktiviteiten).Dit is itselde N-terminale AAA-domein dat organisearret yn in hexamerike ring en ferwideret de gearstallingsfaktor fan 'e 60S 64 ribosomale subunit.liket te wêzen gelyk oan dynein64,65,66.Derneist wurdt de Asp / Glu-rike regio folge troch it MIDAS-domein (metaalion-ôfhinklike side).Troch de grutte grutte fan MDN1 (likernôch 5600 aminosoeren) en syn beheinde homology mei goed bestudearre aaiwiten, is net folle bekend oer syn struktuer en funksje by minsken.Wy identifisearre HLA-A, H2B, en LRCH4 as MDN1 binende partners en iepenbiere harren oriïntaasje as protein kompleksen yn PyMol (Fig. 6A, B).Dizze trije aaiwiten ynteraksje mei it AAA-domein, it dynein-like linkerdomein, en mooglik it MIDAS MDN1-domein.Yn in earder rapport identifisearre affiniteitssuvering fan aasproteinen MDN1 as in proteïne ferbûn mei histon H2B67.Derneist rapporteare in resinte stúdzje ek in ynteraksje tusken MDN en HLA-B yn HCT116-sellen mei affiniteit-suvere massaspektrometry, dy't ús befiningen stypje68.De identifikaasje fan dit kompleks yn IFNα-behannele samples suggerearret in rol foar MDN1 yn interferon-sinjalearring.
Om't HLA-genen heul polymorf binne, hawwe wy sequencing-lêzen ekstrahearre dy't HLA-A, -B, en -C yn kaart bringe fan RNA-sekwinsjegegevens fan Flo-1-sellen (gegevens net werjûn).Peptide-sekwinsjes yn oerienstimming mei de lêzing fan sequencing iepenbiere signifikante ferskillen tusken HLA-A, -B, en -C yn regio's wêr't cross-keppele peptiden yn HLA-A lizze (figuer S3).Dêrnjonken hawwe wy gjin proteïne-oan-proteïne cross-linking observearre fan HLA-B / C-molekulen mei H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4-proteins.Dit suggerearret dat de proteïne ynteraksje fûn tusken HLA-A, MDN1, LRCH1 en HMGA1 is HLA-A spesifyk.Dêrnjonken liet proteomyske analyze fan net-crosslinked samples (Tabel S4) sjen dat HLA-A hegere sekwinsjedekking hat yn ferliking mei HLA-B of HLA-C.De peptiden identifisearre foar HLA-A wiene heech yn yntensiteit yn sawol IFNα-behannele as net-behannele samples.
Om derfoar te soargjen dat de ynteraksjes dy't hjir identifisearre binne net te tankjen wiene oan net-spesifike cross-linking fan twa aaiwiten yn 'e nauwe romtlike buert, befêstige wy fierder twa nije HLA-A-ynteraksjende faktoaren troch it útfieren fan co-immunoprecipitaasje-assays.HLA-A-ynteraksjes mei endogene MDN1 en H2B waarden ûntdutsen yn sawol IFNα-behannele as net-behannele Flo-1-sellen (figuer 7, figuer S4).Wy befêstige dat HLA-A waard finzen nommen troch H2B yn 'e immunoprecipitaten en dat dizze feriening wie troch IFNα-behanneling, om't HLA-A ôfwêzich wie yn' e immunoprecipitaat-samples fan net behannele sellen (figuer 7A).Us gegevens suggerearje lykwols dat IFNα differinsjaal regelet HLA-A-bining oan H2B en MDN1.IFNα induceert assosjaasje tusken H2B en HLA-A, mar ferleget syn assosjaasje mei MDN1.Wy fûnen dat MDN1 ferbûn wie mei HLA-A yn kontrôles, en de tafoeging fan IFNα fermindere dizze ynteraksje ûnôfhinklik fan MDN1-ynduksje troch IFNα (figuer 7B, C).Dêrneist HLA-A immunoprecipitation fêstlein H2B yn A549 sellen (Fig. S4), wat suggerearret dat dizze ynteraksje is ûnôfhinklik fan sel type.Mei-inoar stypje dizze resultaten interferon-bemiddele ynteraksjes fan HLA-A mei H2B en MDN1.
HLA-A co-reinigt H2B en MDN1.Fertsjintwurdige endogene H2B (A) en MDN1 (B) immunoblots waarden immunoprecipitearre út IFNα-behannele Flo-1-sellen en ûndersocht foar de oantsjutte antylders.Mûs en knyn IgG waarden brûkt as in negative kontrôle.(C) Relative hoemannichten (ynput) fan ferskate antigenen wurde ôfbylde troch immunoblots ûndersocht tsjin oantsjutte antykladen, β-actin waard brûkt as ladenkontrôle.
De strukturele eigenskippen fan ien fan 'e interferon-induzearre tige betroubere cross-linked netwurken, H2B-HLA-A-HMGA1, waarden ûndersocht.Wy brûkten molekulêre dynamykmodellering as in alternative oanpak om de konformaasjedynamyk fan 'e aaiwiten belutsen by dit kompleks te begripen (figuer 8).Konklúzjes fan 'e CLMS-gegevens suggerearje de mooglikheid fan ferskate konformaasjes fan' e H2B, HLA-A, en HMGA1-proteinen.Dêrom waarden de folgjende potinsjele kompleksen modeleare yn in solventmedium: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, en H2B-HLA-A-HMGA1.In earste proteïne-protein docking skerm mei it MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) pakket suggerearre mooglike konformaasjes dy't ferskille tusken dizze aaiwiten (fig. 8A).Fisualisaasje fan it dockingproteinkompleks liet ferskate ynteraksjes en mooglike konformaasjes sjen (figuer 5A, 8).Sa wurdt ien mooglike konformaasje werjûn yn figuer 8A (mei markearre cross-links) en it waard fierder evaluearre mei de MD-modelleringspipeline.Dêrnjonken markearret bining fan H2B of HMGA1 oan HLA-A de hegere affiniteit fan H2B foar HLA-A (fig. 8A).
Konformaasjedynamyk fan mooglike netwurken tusken de kompleksen H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, en H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Linkerpaniel is in 2D-kaart (generearre yn SIM-XL-software) fan intramolekulêre (read) en intermolekulêre (blau) crosslinks (crosslink-cutoff ynsteld op 3,5).Derneist wurde identifisearre cross-linking-residuen markearre op 'e struktueren fan' e H2B-, HLA-A- en HMGA1-proteinen.De assosjearre konformaasjes fan dizze aaiwiten waarden ekstrahearre mei de dockingpipeline ymplementearre yn it MOE-pakket.It legere lofterpaniel lit de ferskate mooglike konformaasjes sjen fan 'e H2B-HLA-A- en HMGA1-HLA-A-kompleksen mei ferskate protein-protein-binende affiniteiten (GBVI / WSA dG; kcal / mol).(B) Standertdeviaasje (RMSD) fan atoomposysjes (útsein wetterstofatomen) foar elke proteïnestruktuer.(C) Intermolekulêre proteïne-proteïne wetterstofbân-ynteraksjes fan ferskate simulearre kompleksen, sjoen spesifike ynteraksjes fan doer ≥ 10 ns.De h-bond donor-akseptor cutoff ôfstân waard ynsteld op 3.5 Å, en de donor-H-akseptor cutoff hoeke waard ynsteld op ≥ 160 ° -180 °.(D) Labele residuen dy't HLA-A-protein-protein-ynteraksjes foarmje mei har respektive partners, spanning ≥ 20 ns, ekstrahearre út dummy HLA-A-H2B en HLA-A-HMGA1-kompleksen.Proteinstruktueren fertsjintwurdigje in gemiddelde struktuer fan 100 ns MDS.(E) Ynteraksjes tusken HLA-A-H2B en HLA-A-HMGA1 kompleksen yn ferliking mei ynteraksjes folge troch H2B-HLA simulaasje oer 100 ns basearre op de K of S ynteraksje site tusken de twa peptiden.Kompleksen /HMGA1-HLA-A / H2B-HLA-A-HMGA1.De drompelwearde foar de evaluaasje fan cross-links waard ynsteld op 3.0, en spesifike ynteraksjes fan MDS dy't ≥ 10 ns nimme, waarden rekken holden.Proteinstruktueren waarden visualisearre mei BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, FS) en Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) pakketten.
De stabiliteit fan HLA-A-molekulen yn 'e rin fan' e tiid (standertôfwiking; RMSD as standertdeviaasje; RMSF) joech oan dat de oanwêzigens fan H2B- of HMGA1-proteinen yn 'e kompleksen HLA-A stabilisearre (figuer 8B, figuer S5).It HMGA1-proteïne bindet strak oan 'e B2M-side fan HLA-A, wêrtroch't de stabiliteit fan' e HLA-A-aminosoeren yn 'e HLA-A-HMGA1- of H2B-HLA-A-HMGA1-kompleks feroarsake wurdt (figuer 8B, figuer S5).benammen, HLA-residuen ~60-90 en ~180-210 waarden fûn minder fleksibel yn 'e oanwêzigens fan H2B (fig. 8B).H2B en HMGA1 toande bettere bining oan HLA-A yn de H2B-HLA-A-HMGA1 kompleks fergelike mei HLA-A bining oan H2B of HMGA1 allinnich (figuer 8C, D; Tabel S5).Residuen belutsen by wetterstofbonding (MD modeleare hege besetting ≥ 10 ns) falle gear mei CLMS-ynteraksjesites (K of S-residuen) yn it kompleks, wat suggerearret dat de ynteraksjes identifisearre troch CLMS tige betrouber binne.Betrouberens (fig. 8E).Yn CLMS- en MD-modellearring waarden HLA-A-residuen tusken sawat 190-210 en sawat 200-220 aminosoeren fûn om respektivelik H2B en HMGA1 te binen (FIG. 8E).
Protein-protein-ynteraksjes foarmje dynamyske strukturele netwurken dy't intrazellulêre kommunikaasje bemiddelje yn antwurd op bepaalde stimuli.Om't in protte proteomika-oanpak feroaringen yn it algemiene steady-state-nivo fan in proteïne detektearje, fereasket proteïne-proteïne-ynteraksjedynamyk ekstra ark om binende ynterfaces te fangen, en CLMS is ien sa'n ark.It interferon-sinjaalsysteem is in cytokine-netwurk dat sellen mooglik makket om te reagearjen op in ferskaat oan miljeu-patogene en yntrinsike patologyske sinjalen, dy't kulminearje yn 'e yndeksje fan subsets fan interferon-inducible proteins.Wy tapasten CLMS om te bepalen as nije proteïne-proteïne-ynteraksjes koene wurde identifisearre ûnder in paniel fan interferon-induzearre proteïnen.Globale proteïne-cross-linking-analyse yn in interferon-responsyf Flo-1-selmodel waard brûkt om proteïnekompleksen te fangen.Ekstraksje fan tryptyske peptiden út net-ferbûne en cross-keppele sellen makket it mooglik om peptide te tellen, paadferriking, en peptide-lingteferdieling mei definieare LFQ-yntensiteit.Canonical interferon-inducible proteins waarden identifisearre as in positive ynterne kontrôle, wylst nije intermolecular en intramolecular cross-linked addukten fan kanonike interferon-inducible proteins lykas MX1, UP18, OAS3 en STAT1 waarden waarnommen.Ferskate strukturele funksjes en ynteraksjes yn funksjonele gebieten binne ûndersocht.
In ynteraksje tusken HLA-A, MDN1 en H2B waard ûntdutsen troch immunoblotting yn Flo-1 en A549 sellen behannele en net behannele mei IFNα.Us resultaten markearje dat HLA-A kompleksen mei H2B op in IFNα-ôfhinklike manier.Us wurk fertsjintwurdiget in nijsgjirrige avenue foar fierdere ferkenning fan de ko-lokalisaasje fan dizze twa kompleksen.It soe ek ynteressant wêze om de CLMS-oanpak út te wreidzjen nei in paniel fan sellenlinen om sel-type-ûnôfhinklike interferon-bemiddele proteïne-ynteraksjes te identifisearjen.Uteinlik brûkten wy MD-modellering as in alternative oanpak om de konformaasjedynamyk te begripen fan proteïnen belutsen by it H2BFS-HLA-A-HMGA1-kompleks, dat intramolekulêre en intermolekulêre krúspetearen folge.Konklúzjes fan 'e CLMS-gegevens suggerearje de mooglikheid fan ferskate konformaasjes fan' e H2BFS, HLA-A, en HMGA1-proteinen.De mooglike ferskillende konformaasjes tusken dizze dockingproteinkompleksen iepenbiere ferskate ynteraksjes fergelykber mei dy observearre yn 'e CLMS-dataset.Ien fan 'e wichtichste sterke punten fan ús metoade is dat it maklike identifikaasje mooglik makket fan ynteraksje mei heul polymorphyske genen lykas HLA, dus it sil ynteressant wêze om ynteraksjes te studearjen fan HLA-haplotype-spesifike aaiwiten dy't oars lestich binne te studearjen.Mei-inoar bewize ús gegevens dat CLMS kin wurde brûkt om ús begryp fan interferon-induzearre sinjaalnetwurken út te wreidzjen en in basis te jaan foar it bestudearjen fan mear komplekse ynterzellulêre systemen yn 'e tumormikroomjouwing.
Flo-1-sellen waarden krigen fan ATCC en bewarre yn DMEM (Gibco) oanfolle mei 1% penicilline / streptomycin (Invitrogen), 10% fetale bovine serum (Gibco) en opslein by 37 ° C en 5% CO2.Incubation.Sellen waarden groeid oant 70-80% gearrin foardat se behannele waarden mei IFNα14 (produsearre troch Edinburgh Protein Production Facility).Alle oare gemikaliën en reagentia waarden kocht fan Sigma Aldrich, útsein as oars oanjûn.
Flo-1 sellen waarden kultivearre yn 6-well platen en de oare deis waarden de sellen behannele mei 10 ng / ml IFNα14 foar 24 oeren oant likernôch 80% gearrin.Sellen waarden trije kear wosken mei PBS en ligearre mei fris taret DSS (Thermo Fisher Scientific) (oplost yn DMSO) yn PBS foar 5 min by 37 ° C. oant in definitive konsintraasje fan 0.5 mM.De DSS crosslinking-reaksje waard ferfongen troch PBS en oerbleaune DSS waard quenched troch it tafoegjen fan 20 mM Tris (pH 8.0) yn PBS foar 15 min by 37 ° C.Sellen waarden sammele troch skrapping en sammele yn lege binende buizen (Axygen).
De sel pellet waard lysed mei 300 µl urea lysis buffer (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) foar 30 min by keamertemperatuer mei ynsidintele shaking.Alle sintrifugaasjestappen waarden útfierd by 14.000 xg by 8 ° C.Centrifuge it lysate foar 10 minuten en ferpleatse de supernatant nei in nije buis.De oerbleaune dúdlike dieltsjes waarden oplost yn 150 μl fan 'e twadde lysisbuffer (2 M urea, 2% (w / v) SDS (natriumdodecylsulfat)) foar 30 minuten of mear oant in homogene wetterige oplossing waard krigen.It lysate waard 20 minuten sintrifuge en de supernatant waard mingd mei it lysate krigen yn 'e foarige stap.Proteinkonsintraasjes waarden beoardiele mei de Micro BCA-assay (Thermo Fisher Scientific) neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant foar mikroplateprosedueres.De samples waarden fluch beferzen yn floeibere stikstof en opslein by -80 ° C.
Likernôch 100 μg fan oplosber cross-linked proteïne waard ferwurke mei in wizige filtration sample tarieding protokol (FASP) lykas beskreaun troch Wisniewski et al.69 Koartsein, it aaiwyt wurdt crosslinked mei 200 µl fan urea buffer (8 M urea yn 0,1 M Tris, pH 8,5), vortexed en halved.Alle sintrifugaasjestappen waarden útfierd by 14.000 xg by 25 ° C.De earste helte fan it cross-keppele protein lysate waard oerbrocht nei in 10 kDa Microcon centrifugal filter apparaat foarsjoen fan in Ultracel-10 membraan (Merck), folge troch centrifugation op it filter foar 25 minuten.Foegje dan de twadde helte fan it proteïne oan it filter en werhelje deselde stappen.Protein herstel waard útfierd troch it tafoegjen fan 100 μl fan 17 mM tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) yn urea buffer.Herstel waard op in thermomixer roer by 600 rpm foar 30 minuten by 37 ° C.Derneist waard de kolom sintrifugeare en it fermindere cross-keppele proteïne waard alkylearre mei 100 μl fan 50 mM iodacetamide yn ureabuffer.De alkyleringsreaksje waard útfierd by keamertemperatuer foar 20 minuten yn it tsjuster.Rotearje de kolom, waskje de kolommuorren 3 kear mei 100 µl ureabuffer, en sintrifuge dan.Deselde operaasje waard 3 kear útfierd mei 100 μl fan 100 mM ammoniumbikarbonat.Foardat trypsinisaasje, ferfange de sammelbuis mei in nije.Foegje spiisfertarringsbuffer ta mei 50 mM ammoniumbikarbonaat en 1 µl trypsine fertinne yn trypsinbuffer (Promega).De ferhâlding fan trypsin oant proteïne waard hâlden op likernôch 1:33, en spiisfertarring reaksjes waarden incubated nachts by 37 ° C. yn in fochtige keamer.De crosslinked peptide waard eluearre út it filter troch centrifugation foar 25 minuten.Peptide-herstel waard ferbettere troch it tafoegjen fan 50 μl fan 0,5 M NaCl oan it filter, folge troch 25 minuten sintrifugaasje.
C18 Micro Spin kolommen (Harvard Apparatus) waarden brûkt om desalt cross-keppele tryptic peptiden nei oanlieding fan it protokol beskreaun troch Bouchal et al.70 mei lytse oanpassings.Koartsein, C18 spin kolommen waarden aktivearre mei trije wassen fan 0,1% formic acid (FA) yn acetonitril (AcN) (Merck) en twa wassen fan 0,1% FA.De kolom waard hydrateare mei 0,1% FA foar 15 minuten.Laad monsters yn spin kolommen en waskje 3 kear mei 0,1% FA.De desalted peptiden waarden sequentially eluearre mei in stapsgewijze gradient mei 50%, 80% en 100% AcN yn 0,1% FA.De samples waarden droege yn in SpeedVac Plus-konsintrator (Eppendorf) oant de oerbliuwende floeistof folslein ferdwûn.De eluearre peptiden waarden oplost yn 100 μl fan 0.08% trifluoracetic acid yn 2.5% AcN en de konsintraasjes waarden mjitten op in NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Likernôch 1 μg fan crosslinked peptide per stekproef waard ynjeksje yn it LC-MS / MS systeem.
Cross-keppele peptiden waarden skieden op in UltiMate 3000 RSLCnano LC-systeem (Thermo Scientific) ferbûn mei in Orbitrap Exploris 480 massaspektrometer (Thermo Scientific).Cross-keppele peptiden waarden sammele op in 300 µm ID, 5 mm lange µ-pre-kolom C18 capture kolom ynpakt mei C18 PepMap100 sorbint en 5 µm PepMap sorbint (Thermo Scientific).Laad de pompstream ynsteld op 5 µl/min 0,08% trifluoracetic acid oplost yn 2,5% AcN.Cross-keppele peptiden waarden skieden op in analytyske fusearre silika-kolom mei in ynderlike diameter fan 75 μm en in lingte fan 150 mm, fol mei in 2 μm PepMap-sorbint (Thermo Scientific).Mobile fazen A en B bestie út respektivelik 0,1% FA yn wetter en 0,1% FA yn acetonitril.De gradient begjint by 2,5% B en nimt lineêr ta 40% B oer 90 minuten, dan nei 90% B oer de folgjende 2 minuten.De komposysje fan 'e mobile faze waard 10 minuten op 90% B bewarre en fermindere dan lineêr nei 2.5% B oer 2 minuten.De kolom waard lykwichtich op 2,5% B foar 8 minuten foar de folgjende syklus.Cross-keppele peptiden elutearre út 'e analytyske kolom waarden ionisearre yn in nanoelectrospray ionisaasje (NSI) boarne en ynjeksje yn in Exploris 480 massaspektrometer (Thermo Scientific).
De Orbitrap Exploris 480 massaspektrometer operearre yn 'e positive gegevenskorrelaasjemodus.In folsleine scan waard útfierd yn seksjemodus mei in resolúsje fan 120.000 mei berikynstellingen fan m / z 350 Th oant m / z 2000 Th.It normalisearre AGC-doel waard ynsteld op 300% mei in maksimale ynfiertiid fan 50ms.Monoisotopyske peakdeteksje is fêststeld foar peptiden.De parameter foar beheiningrelaksje wurdt ynsteld op wier as te min foarrinners fûn wurde.De minimale ionyske sterkte fan 'e foarrinner waard ynsteld op 5.0e3 en foarrinnerladingsstaten oant +8 waarden opnommen yn' e eksperiminten.
De syklustiid tusken grutte scans yn gegevenskorrelaasjemodus waard ynsteld op 2,5 sekonden.Dynamyske massa útsluting waard ynsteld op 20 s nei de earste fragmintaasje fan it foarrinner ion.It foarrinner-isolaasjefinster waard ynsteld op 2 Th.It type normalisearre botsing enerzjy mei in fêste botsing enerzjy modus waard keazen yn in gegevens ôfhinklik MS / MS scan.Botsing enerzjy ynsteld op 30%.De Orbitrap-resolúsje waard ynsteld op 15,000 en it AGC-doel op 100%.De oanpaste maksimale ynjeksjetiid is ynsteld op 60 millisekonden.
Foar it folgjen fan it proteïne-proteïne-netwurk yn cross-keppele samples, ferwurke wy de rauwe bestannen mei it MaxQuant-pakket (ferzje 1.6.12.0) 26,27 om traceable peptiden / proteïnen yn 'e samples te identifisearjen.Derneist waarden ferlykbere proteomyske analyzes útfierd op uncrosslinked Flo-1-samples behannele en net behannele mei IFNα.MS/MS-gegevens waarden socht yn 'e UniProt minsklike database (www.uniprot.org) (upload 12 augustus 2020, befettet 75,093 ynstjoerings) mei de ynboude sykmasjine Andromeda27.It sykjen waard útfierd sûnder de spesifisiteit fan it enzym oan te jaan en ferskate modifikaasjes fan deamidaasje (N, Q) en oksidaasje (M).Foarrinner massa tolerânsjes waarden ynsteld op 20 ppm en produkt ionen op 0,02 Da.De earste en maksimale massa ôfwiking waard ynsteld op 10 ppm.De maksimale massa fan it peptide waard ynsteld op 4600 Da en de folchoarderlikens waard ynsteld tusken 7 en 25 aminosoeren (aa).Fierdere statistyske analyze waard útfierd mei it programma Perseus (ferzje 1.6.10.45).Proteinynhâld waard berekkene troch it normalisearjen fan de spektrale yntensiteit fan it proteïne (LFQ-yntensiteit; net-labele kwantifikaasje)27 en de yntensiteitswearden waarden omboud ta Log2.In hiërargyske klustering fan aaiwiten identifisearre troch harren peptide yntinsiteit waard boud mei help fan de pheatmap (v1.0.12) pakket yn R (v 4.1.2).Pathway-ferrikingsanalyse waard útfierd mei de Reactome-paaddatabase foar IFNα-behannele aaiwiten dy't mear as fjouwer kear aktivearre wiene yn ferliking mei net-behannele samples.
Identifikaasje fan lysine (K) of serine (S) spesifike gemyske crosslinks fan protein kompleksen kontrolearre troch LC-MS / MS waard útfierd mei help fan in spektroskopyske identifikaasje masine (SIM-XL) foar cross-linked peptiden (SIM-XL)29.Earst waarden mooglike ynteraksjes tusken interferon-assosjearre (IFN) DNA-skaderesistinsjesignature (IRDS) genen ûndersocht mei de IRDS-protein-dataset beskreaun yn Padariya et al.28.Screening fan alle betingsten en werhellingen fan 'e heule minsklike UniProt is berekkeningsintensyf, dus de heule minsklike UniProt-database (www.uniprot.org) (downloade 12 augustus 2020, befettet 75,093 ynstjoerings) tsjin IFNα-behannele werhellingen.Ien fan 'e filters foar hege fertrouwen ynteraksjes.Dizze krigen ynteraksjes mei hege betsjutting waarden útwreide en hifke yn alle werhellingen en betingsten.
Yn SIM-XL waard DSS brûkt foar de crosslinker (XL) en de XL gewicht shift en modifikaasje gewicht shift waarden ynsteld op 138.06 en 156.07, respektivelik.De folgjende crosslinking-reaksjesites wurde beskôge: KK, KS en KN-TERM, sûnder reporter-ionen.Sawol foarrinner as fragmint ppm waarden ynsteld op 20 en de Xrea-drompel waard ynsteld op 0.15.Trypsin waard beskôge as folslein spesifyk, en in hege-enerzjy C-trap (HCD) fragmintaasje metoade waard útfierd.De XCorr dynamyske DB-reduksjedrompel en it minimale oantal peptiden foar dynamyske DB-reduksje waarden ynsteld op respektivelik 2.5 en 2.Oare parameters binne: monoisotope kâns en pyk tafal cutoff, minimum 4 AA-residuen per strand en maksimum strand lading, en 3 maksima fan miste splits.De resultearjende stitched 2D-kaarten waarden analysearre yn (SIM-XL) en de xQuest28 grafyske foarstelling waard brûkt om de 2D-kaarten te bouwen.Protein crosslinks op proteïnestruktueren wurde levere yn PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, ferzje 2.0 Schrödinger, LLC).
Proteinmodelstruktueren waarden makke mei de Phyre2-tsjinner (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 mei de prinsipes fan homologymodellering en ymplemintaasje fan 'e "Hidden Markov Method".Phyre2 genereart modelstruktueren basearre op folchoarderôfstimming mei bekende proteinstruktueren.Foar H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, en MDN1 aaiwiten, template struktueren 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, en 6i2665 waarden brûkt.Derneist waard de struktuer fan AlphaFold71 MX1, UBP18 en ROBO1 ek beskôge.De proteïnestruktuer waard visualisearre mei it BIOVIA Discovery Studio Visualizer-pakket (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, FS) en it pakket Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).