ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Foar Chemical Industry gemyske komponint, Tekoart oan SPECC1L liedt ta ferhege stabiliteit fan spliced ​​gewrichten en fermindere ôfskieding fan cranial neural crest sellen.

Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex laske buis foar gemyske yndustry

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.is in liedende fabrikant dy't spesjalisearre is yn roestfrij stiel naadleaze buizen, heldere annealed buizen, seamless coiled buizen ensfh.Om klanten te fasilitearjen hawwe wy ek laske buizen en buizen.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.hat de meast avansearre produsearjen en testen apparatuer.Wy kinne jo eask folslein foldwaan.Hiel strikt neffens standert hawwe buizen dy't troch ús produsearre altyd juste OD- en WT-tolerânsje.De tolerânsjekontrôle is strikt yn oerienstimming mei produsearjende noarmen.Us produkten binne altyd tefreden mei klanten.Klanten kochten ús produkten makken mear winsten.
a) OD (bûtendiameter): 3,18 mm oant 101,6 mm
b) WT (wanddikte): 0,5 mm oant 20 mm
c) Lingte: neffens klant syn eask
d) noarmen: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ensfh
e) Prosesmetoade: ERW, EFW ensfh

Sliders dy't trije artikels per dia sjen litte.Brûk de efter- en folgjende knoppen om troch de dia's te bewegen, of de slide-controller-knoppen oan 'e ein om troch elke dia te bewegen.
De cranial neural crest sellen (CNCC) slút de embryonale neurale plooien ôf en migrearje nei de faryngeale bôgen, dy't de measte fan 'e midface-struktueren foarmje.CNCC-dysfunksje spilet in wichtige rol yn 'e etiology fan orofacial cleft, in mienskiplike oanberne misfoarming.Heterozygote SPECC1L mutaasjes binne fûn yn pasjinten mei atypyske en syndrome spjalten.Hjir melde wy ferbettere kleuring fan kanonike adhesive junction (AJ) komponinten, β-catenin en E-cadherin yn kweekte SPECC1L knockdown sellen, en elektroanen mikrografen litte apikaal-basale diffusion fan AJ sjen.Om de rol fan SPECC1L yn kraniofasiale morfogenese te begripen, hawwe wy in Specc1l-deficient mûsmodel makke.Homozygote mutanten binne embryonale deadlik en fertoane beskeadige sluting fan neuronale buis en CNCC-laminaasje.AJ-proteïnekleuring wurdt ferhege yn mutante neurale plooien.Dit AJ-defekt is yn oerienstimming mei in defekt yn CNCC-delaminaasje, dy't AJ-ûntbining fereasket.Derneist hawwe Specc11-mutanten PI3K-AKT-sinjalearring fermindere en apoptose ferhege.In vitro wie mylde ynhibysje fan PI3K-AKT-sinjalearjen yn wyldtype-sellen genôch om AJ-wizigingen te inducearjen.Wichtich, AJ-feroarings dy't feroarsake binne troch SPECC1L-knockdown kinne wurde omkeard troch aktivearring fan 'e PI3K-AKT-paad.Mei-elkoar suggerearje dizze gegevens dat SPECC1L, as in nije regulator fan PI3K-AKT-sinjalearjen en AJ-biology, fereaske is foar sluten fan neurale buis en CNCC-stratifikaasje.
Cranial neural crest sellen (CNCC's) lokalisearje nei it dorsale neuroectoderm en losmeitsje fan it neuroepithelium fan 'e ûntwikkeljende neuronale plooien troch in proses wêrby't de epitheliale-mesenchymale oergong (EMT) 1,2,3.Premigrearjende epitheliale CNCC's fersteure ynterzellulêre knooppunten en wurde migrearjende mesenchymale CNCC's dy't de earste en twadde faryngeale bôgen folje en it measte fan 'e kraniofasjale kraakbeen foarmje.Sa wurde genen dy't de CNCC-funksje regelje, faak fersteurd yn 'e etiology fan kraniofasjale oanberne anomalies lykas orofasiale spleten, meast beynfloedzjend 1/800 berte yn' e FS allinich.Ien fan 'e oanberne deformiteiten8.
Delaminaasje fan 'e CNCC komt oerien mei it sluten fan' e anterior neuronale buis tusken 8.5 en 9.5 dagen fan embryonale ûntwikkeling yn mûzen.Mutanten fan in oantal mûs orofacial cleft-assosjearre genen eksposearje ek in foarm fan neuronale buisdefekt, ynklusyf Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, en Pdgfrα12.De prosessen fan sluting fan neuronale buis en CNCC-stratifikaasje kinne lykwols as ûnôfhinklik beskôge wurde, om't de Splotch-mutante mûs (Pax3) defekten yn 'e sluting fan' e neuronale buis eksposearret sûnder effekt op CNCC-stratifikaasje of migraasje 13,14.Oanfoljende mûsmodellen mei defekten yn CNCC-disseksje en sluting fan neuronale buis sille helpe om de mienskiplike molekulêre basis fan dizze twa prosessen te bepalen.
Isolaasje fan CNCC út neuroepitheliale sellen fereasket it ûntbinen fan adhesive junctions (AJ's), dy't binne gearstald út proteïnekompleksen dy't ûnder oaren E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, en α-actinin ferbûn binne mei actin filaments 2 Overexpresje-stúdzjes E-cadherin yn neurale plooien lieten in reduksje of fertraging yn CNCC-delaminaasje sjen.Oarsom resultearret ûnderdrukking fan E-cadherin yn iere stratifikaasje15,16.In protte fan 'e faktoaren dy't EMT bemiddelje tidens CNCC-stratifikaasje binne transkriptyfaktoaren (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) en ekstrazellulêre matrix (ECM) remodelingproteinen lykas matrixmetalloproteinasen (MMP's), lykwols binne CNCC's direkte cytoskeletale AJ-regulators. noch net bekend.It is bekend dat de PI3K-AKT-paad E-cadherin-nivo's antagonisearje, benammen út kankerûndersyk17.Resinte stúdzjes hawwe oantoand dat ferlies fan PDGFα-basearre PI3K-AKT-sinjalearring yn mûzen liedt ta kraniofasjale abnormaliteiten, ynklusyf spjalte ferwulft en neuralbuisdefekten12.De relaasje tusken it PI3K-AKT-paad en AJ-stabiliteit by CNCC-stratifikaasje is lykwols ûndúdlik.
Wy hawwe earder SPECC1L identifisearre as it earste mutante gen yn twa minsken mei in swiere spleet dy't út 'e mûle nei it each rint, bekend as oblique cleft (ObFC) of Tessier IV18 cleft.SPECC1L-mutaasjes binne identifisearre yn twa multygeneraasjefamyljes mei it autosomale dominante Opitz G/BBB-syndroom (OMIM #145410), wêryn beynfloede persoanen hyperdistance en spjalte lip/gehemelte19 eksposearre, en yn ien famylje mei Tibi-overdistancesyndroom (OMIM #145420)20 .mear as de helte fan gefallen fan Opitz G / BBB syndroom binne X-keppele (OMIM #300000) en wurde feroarsake troch mutaasjes yn de MID1 gen, dat kodearret protein 22 fan de microtubule-assosjearre sel skelet.Wy hypoteze dat SPECC1L, ek in proteïne assosjearre mei mikrotubules en it actin cytoskelet, kin sinjalearring bemiddelje dy't nedich is foar actin cytoskelet remodeling tidens sel adhesion en migraasje 18.Troch in vitro en in vivo stúdzjes beskriuwe wy no SPECC1L as in nije regulator fan AJ-stabiliteit fia PI3K-AKT-sinjalearring.Op it sellulêre nivo resultearre SPECC1L-tekoart yn in fermindering fan it nivo fan it pan-AKT-proteïne en in ferheging fan 'e apikale-basale fersprieding fan AJ, dy't waard elimineare troch gemyske aktivearring fan' e AKT-paad.Yn vivo, Specc11-deficiente embryo's toane beheinde sluting fan neuronale buis en fermindere CNCC-disseksje.Sa funksjonearret SPECC1L yn heul regulearre seladhesion-basearre sinjalearring dy't nedich is foar normale CNCC-funksje tidens gesichtsmorfogenese.
Om de rol fan SPECC1L op sellulêr nivo te karakterisearjen, brûkten wy de earder beskreaune stabile osteosarcoma-selline U2OS tekoart yn SPECC1L18.Dizze stabile U2OS-sellen mei SPECC1L (kd) knockdown hiene in matige (60-70%) fermindering yn 'e nivo's fan SPECC1L-transkrippen en aaiwiten, tegearre mei defekten yn migraasje en reorganisaasje fan it actin-cytoskelet 18. Yn tsjinstelling, in slimme transiente fermindering yn SPECC1L hat bliken dien te lieden ta mitotyske defekten 23 .Nei fierdere karakterisearring fûnen wy dat ús stabile SPECC1L-kd-sellen morfology feroare op in heul hege mjitte fan gearrin (figuer 1).Yndividuele kontrôlesellen en kd-sellen by lege gearrin seagen ferlykber (figuer 1A, D).24 oeren nei fúzje, kontrôle sellen behâlden harren cuboidal foarm (Fig. 1B, E), wylst SPECC1L-kd sellen ferlingd (Fig. 1C, F).De omfang fan dizze feroaring yn selfoarm waard fêstlein troch in vivo live ôfbylding fan kontrôlesellen en kd-sellen (film 1).Om de rol fan SPECC1L yn konfluinte sellen te bepalen, ûndersochten wy earst syn ekspresje.Wy fûnen dat SPECC1L-proteïnenivo's tanommen by fúzje (figuer 1G), wylst SPECC1L-transkripsjenivo's net tanamen (figuer 1H).Dêrneist, as sel tichtens tanommen, SPECC1L proteïne opboud op ynterzellulêre grinzen (Fig. 2A-E), mei in patroan oerlappe mei dat fan membraan-assosjearre β-catenin (Fig. 2A'-E').Mei it each op de assosjaasje fan SPECC1L mei it actin cytoskelet 18,23 hawwe wy hypoteze dat SPECC1L ynteraksje mei actin-basearre adhesive junctions (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) sellen ferlingje by hege gearrin (F) yn ferliking mei kontrôle U2OS sellen (AC).Hjir werjûn binne trije fan 'e seis tiidpunten (T1, T3, T6) dy't wy selekteare foar ferskate seldichtheden.(G) Western blot-analyze dy't sjen litte dat it SPECC1L-proteïne stabilisearre is op in hege graad fan gearrin yn ferliking mei in lege graad fan gearrin yn kontrôlesellen.Western blot fan SPECC1L toant de ferwachte 120 kDa band en in heger molekulêre gewicht band, mooglik post-translationally wizige (*).Western blot analyze waard útfierd ûnder deselde betingsten foar lege en hege gearrin.Ofbyldings dy't SPECC1L sjen litte by lege en hege gearrin waarden nommen út deselde blot.Deselde blot waard fuortsmiten en opnij ûndersocht mei β-actin antibody.(H) Kwantitative RT-PCR-analyse liet gjin signifikante feroaringen sjen yn SPECC1L-transkriptnivo's.Flaterbalken fertsjintwurdigje SEM's fan fjouwer ûnôfhinklike eksperiminten.
(AE) Wy keazen seis tiidpunten (T1-T6) dy't in berik fan seldichtheden fertsjintwurdigje om selfoarmanalyse en AJ-feroarings yn U2OS-sellen te normalisearjen mei SPECC1L knockdown (kd).De earste fiif fan dizze tiidpunten omfette inkele sellen (T1), 50-70% fúzje fan lytse sel klusters (T2), fúzje sûnder reshaping kd sellen (T3), reshaping kd sellen (T4), en 24 oere feroarings.yn 'e efterste foarm fan kd (T5) sellen.It SPECC1L-proteïne waard foaral ferspraat yn it cytoplasma by T1 (A), mar syn accumulation waard waarnommen by ynterzellulêre grinzen op folgjende tiidpunten (BE-E, pylken).(FJ) β-catenin toant ferlykbere accumulation by ynterzellulêre grinzen ferbûn mei it AJ-kompleks.(A'-E') SPECC1L en β-catenin litte oerlappende kleuring sjen by selgrinzen by hege seltensiteit (pylken).(F'-J') Yn SPECC1L-kd sellen, β-catenin kleuring ferskynt normaal by lege sel tichtens (F'-H'), mar wreidet út as sel foarm feroaret (I', J'; pylken), wat oanjout dat AJ binne feroare.Bars = 10 µm.
Wy besochten doe it effekt fan SPECC1L-tekoart op AJ te bepalen.Wy brûkten ferskate AJ-assosjearre markers, ynklusyf de kanonike komponinten F-actin, myosin IIb, β-catenin, en E-cadherin24,25,26,27.Actin stress fezels ferhege yn SPECC1L-kd sellen lykas earder beskreaun (Fig. 3A, B) 18.Myosin IIb ferbûn mei actin filaments toande in ferlykbere ferheging fan SPECC1L-kd sellen yn vitro (Fig. 3C, D).AJ-assosjearre β-catenin bindet oan cadherin by de sel membraan, showing in normale "honeycomb" ekspresje patroan yn kontrôle cubocytes (Fig. 3E, G).Nijsgjirrich, yn platte bylden mei help fan confocal mikroskopy, toande β-catenin (Fig. 3E, F) en E-cadherin (Fig. 3G, H) kleuring op de sel membraan fan konfluent SPECC1L-deficient sellen promininte patroanen fan útwreide kleuring.Dizze útwreiding fan AJ-assosjearre β-catenin-kleuring yn kd-sellen wie it meast útsprutsen by gearrin, mar ferskynde foar feroaringen yn selfoarm (figuer 2F-J, F'-J').Om de fysike aard fan dizze útwreide AJ-kleuring te bepalen, ûndersochten wy selgrinzen op it apikaal-basale oerflak fan SPECC1L-kd U2OS-sellen troch transmissyelektronenmikroskopie (TEM) (figuer 3I, J).Yn tsjinstelling ta kontrôle sellen (Fig. 3I), dy't hie aparte elektroanen tichte regio oantsjuttings foar AJ (pylken), toande kd sellen (Fig. 3J) grutte, oanswettende regio fan hege elektroanen tichtens yndikatyf fan AJ lâns de apicobasal fleanmasine..Dêrneist, op dwerse seksjes, wy observearre wiidweidige sel membraan plooien yn kd sellen (Fig. S1A, B), dat ferklearret it útwreide patroan fan β-catenin en E-cadherin kleuring bands (Fig. 3F, H).Yn stipe fan de rol fan SPECC1L yn AJs, β-catenin waard co-immunoprecipitated mei SPECC1L yn lysates fan konfluent U2OS sellen (Fig. 3K).Tegearre mei útwreide immunokleuring foar AJ-markers wie TEM-analyze yn oerienstimming mei ús hypoteze dat SPECC1L-tekoart AJ apikaal-basale tichtens en fariânsje fergruttet.
(AH) Ferhege F-actin-kleuring yn kd-sellen op 48 oeren nei fúzje (T6; A, B).Feroare kleuring fan myosin IIb ferbûn mei F-actin (C, D).It glêde patroan fan β-catenin en E-cadherin membraan kleuring yn kontrôle sellen (E, G) waard fersterke yn SPECC1L-kd (F, H) sellen.Bars = 10 µm.(I-J) Elektronenmikrografen dy't de apikaal-basale ynterzellulêre junction observearje.Kontrôlesellen litte ûnderskate elektroanendichte regio's sjen dy't kleverige krusingen oanjaan (I, pylken).Yn tsjinstelling, de hiele apikale-basale knooppunt yn SPECC1L-kd sellen ferskynde elektron dichte (J, pylken), wat oanjout tanommen tichtens en fersprieding fan adhesive junctions.(K) β-catenin waard ko-immunoprecipitearre mei SPECC1L yn konfluent U2OS cell lysates.Ofbylding nommen fan ien plak dy't ien fan fjouwer ûnôfhinklike eksperiminten fertsjintwurdiget.
Om de rol fan SPECC1L yn kraniofasiale morfogenese te begripen, makken wy in Specc1l-deficient mûsmodel mei twa ûnôfhinklike ES-trapsellinen, DTM096 en RRH048 (BayGenomics, CA), dy't intron 1 fertsjintwurdigje en Specc1l-transkrippen waarden fêstlein op 15 (figuer 1) .4A, figuer S2).De genomyske lokaasje fan 'e decoy-vektor-ynfoegje waard bepaald troch folsleine genome-sekwinsje en befêstige troch PCR (Fig. S2).Beide genetrap-ûntwerpen lieten ek yn-frame-fúzje fan 'e Specc11-lacZ-reporters by fangen ta.Dêrom waard lacZ-ekspresje bepaald troch X-gal-kleuring brûkt as in yndikator fan Specc11-ekspresje.Beide allelen lieten ferlykbere lacZ-ekspresjepatroanen sjen, mei de DTM096-gen-trap yn intron 1 dy't sterker ekspresje toant as RRH048 yn intron 15 (net werjûn).Specc1l wurdt lykwols breed útdrukt, mei benammen sterke ekspresje yn 'e neuronale plooien by E8.5 (Figure 4B), yn' e neuronale buis en gesichtsprosessen by E9.5 en E10.5 (Figure 4C, D), en yn ûntwikkeling fan ledematen op e10.5 en eagen (figuer 4D).Wy hawwe earder rapporteare dat SPECC1L-ekspresje yn 'e earste faryngeale bôge by E10.5 oanwêzich wie yn it epithelium en ûnderlizzende mesenchyme18, yn oerienstimming mei de CNCC-lineage.Om SPECC1L-ekspresje yn CNCC te testen, hawwe wy E8.5 neurale plooien (figuer 4E-J) en E9.5 skull-seksjes útfierd (figuer 4K-).By E8.5, SPECC1L kleurde neural plooien intensely (Fig. 4E, H), ynklusyf sellen kleurde mei NCC markers (Fig. 4G, J).By E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) sterk stained migrating CNCC co-stained mei AP2A (Fig. 4L, M) of SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Skematyske foarstelling fan 'e mûs Specc11-gen dy't decoy-vektor-ynfoegje yn ES DTM096 (intron 1) en RRH048 (intron 15) selleklonen toant.(BD) lacZ-kleuring fan heterozygote Specc1lDTM096-embryo's dy't Specc1l-ekspresje fertsjintwurdigje fan E8.5 oant E10.5.NE = neuroectoderm, NF = neural fold, PA1 = earste faryngeale bôge.(EP) SPECC1L-immunokleuring mei NCC-markers AP2A en SOX10 yn E8.5 (NF; EJ) neurale plooien en E9.5 (KP) skull-seksjes.SPECC1L-kleuring waard breed waarnommen yn neurale plooien E8.5 (E, H; pylkpunten), ynklusyf sellen markearre mei AP2A (F, G; pylkpunten) en SOX10 (I, J; pylkpunten).By E9.5, SPECC1L sterk kleurde migrearjende CNCC's (K, N; pylken) markearre AP2A (L, M; pylken) en SOX10 (O, P; pylken).
Crossing tusken heterozygote Specc1lDTM096/+ en Specc1lRRH048/+ mûzen lit sjen dat de twa gene trap alleles net komplemintêr binne en dat gearstalde heterozygoten en embryonale homozygoten foar beide gene trap allele embryonaal deadlik binne (tabel S1).Mendelian ferhâldingen oanjûn in delgong yn it oerlibjen taryf fan heterozygotes by berte (ferwachte 1.34 vs. 2.0).Wy notearre lege perinatale mortaliteit ûnder heterozygoten, guon hiene kraniofasiale anomalies (Fig. S3).De lege penetraasje fan dizze perinatale kraniofasiale fenotypen makket it lykwols lestich om har ûnderlizzende pathofysiologyske meganismen te studearjen.Dêrom rjochte wy ús op it embryonale deadlike fenotype fan homozygote Specc11-mutanten.
De measte gearstalde heterozygote of homozygote Specc1lDTM096 / RRH048 mutante embryo's ûntwikkelen net nei E9.5-10.5 (Fig. 5A-D), en de neuronale buis slute net foarôf (Fig. 5B, D) en soms sletten efterôf (net werjûn) ..Dit defekt yn 'e sluting fan' e kraniale neuronale buis wie ferbûn mei de mearderheid fan CNCC markearre DLX2 oerbleaun yn 'e neurale plooien by E10.5, wat oanjout dat gjin dissection (figuer 5A'-D').Om te bepalen as de totale grutte fan CNCC ek waard fermindere, taggen wy CNCC-rigels mei GFP yn ús genetraplinen mei Wnt1-Cre en ROSAmTmG.Wy streame sorteare GFP+ NCC en GFP- (RFP+) net-NCC fan hiele embryo's.By E9.5 feroare it oanpart fan flow-sortearre GFP-labele CNCC's net signifikant tusken WT en mutante embryo's (net werjûn), wat oanjout op normale CNCC-spesifikaasje.Dêrom, wy hypoteze dat oerbleaune Wnt1-Cre en DLX2 kleuring yn bleatsteld neural plooien (figuer 5B ') wie fanwege defecte CNCC layering, mooglik troch ferhege tichtheid of dispersion fan AJ sellen, lykas sjoen yn SPECC1L-kd sellen.Wy brûkten de NCC-markers SOX10, AP2A, en DLX2 om de oanwêzigens fan CNCC yn 'e neurale fold te befestigjen (figuer 5E-R).By E8.5 waard neurale fold-kleuring foar alle trije NCC-markers waarnommen yn seksjes fan WT (Fig. 5E, G, I) en Specc1l-mutant (Fig. 5F, H, J).By E9.5, wylst NCC-markers migrearjende NCC yn WT-seksjes kleurden (Fig. 5M, O, Q), waard residuele NCC-kleuring waarnommen yn bleatstelde neurale plooien fan Specc1l mutante embryos (Fig. 5N, P, R).Om't SOX10 en DLX2 migrearjende CNCC's markearje, suggerearret dit resultaat dat SPECC1L-defizite CNCC's post-migratory spesifikaasje berikke, mar mislearje te migrearjen fan neurale plooien.
Specc11-tekoart liedt ta defekte sluting fan neuronale buis, delaminaasje fan kraniale neurale krystsellen en AJ's.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo dy't migrearjende cranial neural crest sellen (CNCC) drage markearre mei Wnt1-Cre (A').Yn tsjinstelling toane Specc11 mutante embryo's iepen neurale plooien (B), pylken) en CNCC's dy't net migrearre binne (B', pylken).(C, D') Heldere fjildôfbyldings (C, D') en immunokleuring (C', D') fan 'e CNCC-marker DLX2 fan E10.5 WT-embryo's (C, C') en Specc1l (D, D').Yn WT E10.5-embryo's kolonisearje DLX2-positive CNCC de kieuwbôgen (C', pylken), wylst yn mutanten opfallende kleuring bliuwt yn 'e iepen neurale plooien (D', pylken) en yn 'e earste faryngeale bôgen (D', pylken).) mei wat kleurjen (pylken) wat oanjout op earme delaminaasje en migraasje fan CNCC.ER) Seksjes fan WT- en Specc1l-mutante embryo's yn stadia E8.5 (E-L) en E9.5 (M-R) waarden markearre mei NCC-markers SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) en DLX2 (I, J, Q, R).By E8.5 waard NCC-kleuring waarnommen yn wylde-type neurale fold (NF) en mutante seksjes.Co-staining fan SOX10 en β-catenin yn E8.5 WT (K) en mutant (L) die bliken ferhege β-catenin kleuring by selgrinzen yn 'e neurale plooien.By E9.5 waard wyld-type kleuring fan migrearjende CNCC's (M, O, Q) waarnommen, wylst yn mutanten unstratifisearre CNCC's iepen neurale plooien (N, P, R) kleurden.(S – Z) In vivo AJ-labelingsanalyse yn koronale seksjes fan WT- en Specc11DTM096 / RRH048-embryo's mei de E9.5-mutaasje.In ûngefear trochsneedflak wurdt werjûn yn 'e rjochter boppeste hoeke.Yn seksjes fan mutante weefsels waard ferhege kleuring fan F-actin (S, T) en myosine IIb (U, V) waarnommen.Fergelykber mei de resultaten fan in vitro yn Fig.(AA-BB) In elektroanenmikrografy fan in seksje fan in wyldtype embryo dy't bûten de grins fan 'e apikaal-basale sel sjocht, toant in ûnderskate elektroanendichte regio dy't oanjout foar adhesive knooppunten (AA, pylken).Yn tsjinstelling, yn seksjes fan Specc11 mutante embryo's (BB, pylken), is de hiele apicobasale knooppunt elektroanendicht, wat oanjout op in ferhege tichtens en fersprieding fan adhesive junctions.
Om ús hypoteze te testen dat fermindere lagen is troch feroare AJ, ûndersochten wy AJ-labeling yn bleatstelde neurele plooien fan Specc1l mutante embryos (fig. 5S-Z).Wy observearre in ferheging fan actin stress fezels (Fig. 5S, T) en in gearhingjende ferhege lokalisaasje fan myosin IIB kleuring op actin fezels (Fig. 5U, V).Wichtich, wy observearre ferhege kleuring fan β-catenin (Fig. 5W, X) en E-cadherin (Fig. 5Y, Z) by ynterzellulêre grinzen.Wy ûndersochten ek β-catenin-kleuring fan NCC yn 'e neuronale plooien fan E8.5-embryos (Fig. 5K, L).β-catenin kleuring ferskynde sterker yn Specc1l mutant neural plooien (Fig. 5L en K), wat suggerearret dat AJ feroarings wiene begûn.Yn elektroanenmikrografen fan skull-seksjes fan E9.5-embryo's, observearren wy opnij ferhege diffuse elektron-dichte kleuring yn Specc1l mutante embryo's yn ferliking mei WT (Fig. 5AA, BB en S1E-H).Mei-inoar stypje dizze resultaten ús in vitro-resultaten yn SPECC1L-kd U2OS-sellen en suggerearje dat ôfwikende AJ-kleuring foarôfgiet oan CNCC-stratifikaasje yn ús mutante embryo's.
Sjoen de bekende antagonistyske relaasje tusken AKT-aktiviteit en E-cadherin-stabiliteit,17,28 hypoteze wy de belutsenens fan PI3K-AKT-sinjalearring.Dêrneist observearre wy subepidermal blistering yn guon fan ús mutante embryos dy't ûntsnapte deadlikheid (<5%) by E9.5-10.5 en ynstee fêstigen op om E13.5 (Fig. S3).Subepidermale vesicles binne in skaaimerk fan fermindere PI3K-AKT-sinjalearring basearre op PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) rapportearre dat fersteuring fan PDGFRα-basearre PI3K-aktivearring yn PdgfraPI3K / PI3K-mutante embryo's resulteart yn subepidermale fesikels, neuralbuisdefekten, en fenotypen fan spjalte ferwulften.Yndied waarden nivo's fan pan-AKT en aktive phosphorylated Ser473-AKT yn vivo fermindere yn Specc1l mutante weefsels nei E9.5 embryonale arrestaasje (Fig. 6A-D).De fermindering fan nivo's fan phosphorylated Ser473-AKT kin folslein wêze troch de ôfname fan nivo's fan pan-AKT yn vivo (Fig. 6E) en in vitro (Fig. 6F).In in vitro-fermindering waard allinich waarnommen as U2OS-sellen sterk konfluint wiene mei feroaringen yn selfoarm en AJ-tichtens (figuer 6D).Sa suggerearje ús gegevens dat SPECC1L in nije positive regulator is fan PI3K-AKT-sinjalearjen yn kraniofasiale morfogenese.
(A – E) E8.5 (A, B) en E9.5 (C, D) skedel-seksjes as E9.5-lysaten fan Specc1l mutante embryo's (E) dy't nivo's fan aktive phosphorylated S473-AKT en pan-AKT Proteinreduksje sjen litte , ferlike mei kontrôle WT.Western blotting waard útfierd op wyld-type lysates en mutant lysates ûnder deselde betingsten.De bylden werjûn foar SPECC1L waarden nommen út ien blot.Deselde blot waard fuortsmiten en opnij ûndersocht mei anty-pan-ACT en β-actin antykladen.Pan-AKT-nivo's yn E8.5-neurale plooien (A, B) en nivo's fan phosphorylearre S473-AKT yn E9.5-skedel-seksjes waarden signifikant fermindere.(F) Pan-AKT-nivo's waarden lykwols fermindere yn lysaten fan SPECC1L-kd U2OS-sellen dy't by hege gearrin rispe.Flater bars fertsjintwurdigje SEMs út trije ûnôfhinklike Western blot quantifications.(GJ) Seksjes fan WT-embryo's by E9.5 kleurd mei respektivelik KI67 en spjalte caspase 3, mei selproliferaasje (G, G') en lytse apoptotyske aktiviteit (H, H').Specc11 mutante embryo's toane ferlykbere selproliferaasje (I), mar it oantal sellen dat apoptose ûndergiet is signifikant ferhege (J).
Wy ûndersochten dan markers fan proliferaasje en apoptose.Wy hawwe gjin ferskil observearre yn 'e proliferaasje fan E9.5-embryo's (Fig. 6E, G yn ferliking mei I) mei in proliferaasje-yndeks fan 82.5% foar WT-mutanten en 86.5% foar Specc1l-mutanten mjitten troch KI67-kleuring (p <0.56, Fisher's eksakte test).Op deselde manier hawwe wy gjin ferskil yn apoptose beoardiele, mjitten troch kleuring foar spjalte caspase 3 yn neurale plooien by E8.5 oant embryoarrest (net werjûn) (net werjûn).Yn tsjinstelling, apoptosis waard signifikant ferhege yn alle E9.5 mutant embryos (Fig. 6F, H en J).Dizze algemiene ferheging fan apoptose is konsistint mei fermindere PI3K-AKT-sinjalearring en iere embryonale letaliteit29,30,31.
Folgjende, om in kausale rol te befestigjen foar PI3K-AKT-sinjalearjen yn AJ-feroarings yn ús kd-sellen, feroare wy it paad yn kontrôle en kd-sellen gemysk (figuer 7A-F).Wy brûkten as marker it fenotype fan selfoarmferoaring beoardiele yn konfluinte SPECC1L-kd-sellen, dy't wy kwantifisearre mei de ferhâlding fan 'e langste diminsje (lingte) nei de oerienkommende fertikale dimensje (breedte).In ferhâlding fan 1 wurdt ferwachte foar relatyf rûne as kubike sellen (figuer 7G).Neist selfoarm hawwe wy ek befêstige it effekt op AJ troch β-catenin-kleuring (Fig. 7A'-F').Ynhibysje fan 'e PI3K-AKT-paad mei wortmannin wie genôch om selfoarm te feroarjen yn kontrôlesellen (figuer 7A, C) en AJ (figuer 7A').PI3K-AKT activator SC-79 hat gjin ynfloed op sel foarm (Fig. 7A, E) of AJ útwreiding (Fig. 7A ') yn kontrôle sellen.Yn SPECC1L-kd-sellen resultearre fierdere ûnderdrukking fan 'e PI3K-AKT-paad yn ferhege apoptose (Fig. 7B, D) en in markearre ferheging fan β-catenin-kleuring (Fig. 7B'), yn oerienstimming mei ús in vivo swiere mutanten.Wichtich is dat aktivearring fan 'e PI3K-AKT-paad de selfoarm signifikant ferbettere (figuer 7B, F) en AJ-fenotypen (figuer 7B").Feroarings yn sel foarm waard kwantifisearre as sel roundness ratio (CCR) en fergelike foar betsjutting lykas hjirboppe beskreaun (fig. 7G).Yndied, yn kontrôlesellen (Fig. 7G, CCR = 1.56), wie wortmannin-behanneling genôch om de selfoarm signifikant te feroarjen (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) yn 'e mjitte fergelykber mei de waarnommen. yn SPECC1L.-kd sellen (Fig. 7G, CCR = 3.46).Wortmannin behanneling fan SPECC1L-kd sellen (Fig. 7G, CCR = 3.60, negligible) wie net mear signifikant as untreated kd sellen (Fig. 7G, CCR = 3.46, negligible) of wortmannin-behannele kontrôle sellen (Fig. 7G)., CCR = 3,46, negligible) ek beynfloedet sel elongation (7G, CCR = 3,61, negligible).It wichtichste restaurearre SC-79 AKT-aktivator it langwerpige fenotype fan SPECC1L-kd-sellen (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Dizze resultaten befêstigje dat SPECC1L regulearret PI3K-AKT-sinjalearjen en suggerearret dat in matige ôfnimming fan SPECC1L beynfloedet sel adhesion, wylst in sterke ôfnimming liedt ta apoptose (fig. 8).
(A–F') Kontrôle (A, C, E) en SPECC1L-kd (B, D, F) sellen behannele mei PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) of SC-79 activator (E, F) Behanneling .Untreated kontrôle sellen binne cuboidal (A) mei normale β-kat sellulêre kleuring (A'), wylst kd sellen wurde langwerpige (B) mei ferhege β-kat kleuring (B').Nei ûnderdrukking fan 'e PI3K-AKT-paad, ferlingde kontrôlesellen (C) mei β-kat-útwreiding (C'), wylst kd-sellen apoptose (D) begûnen te ûndergean, fergelykber mei ús heul mutearre embryo's en ekstreem ferbettere β-kat sjen litte.kleuring (D').Nei aktivearring fan it PI3K-AKT-paad bleaune kontrôlesellen kuboïdale (E) en hienen normale β-cat (E') kleuring, wylst kd-sellen signifikant ferbettere selfoarm (F) en β-cat (F') kleuring sjen litte, wat oanjout (G) De graad fan selfoarmferoaring yn (AF) waard kwantifisearre mei de selrondingsferhâlding (CCR) fan 'e langste diminsje (lingte) en de oerienkommende fertikale dimensje (breedte) mei MetaMorph-software.Unbehannele (NT) SPECC1L-kd-sellen (CCR = 3.46) wiene signifikant langer dan kontrôlesellen (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Wort's ynhibysje fan 'e PI3K-AKT-paad yn kontrôlesellen wie genôch om in ferlykbere ferlinging yn selfoarm te feroarsaakjen (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Op deselde manier restaurearre AKT-aktivearring troch SC-79 yn SPECC1L-kd-sellen selferlinging nei kontrôlenivo's (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Wortmannin-behanneling fan SPECC1L-kd-sellen resultearre yn ferhege apoptose, mar gjin fierdere ferheging fan selfoarmferoaring (CCR = 3.60) yn ferliking mei net behannele kd (CCR = 3.46, ns) of wortmannin-behannele kontrôlesellen (3.61) waarnommen yn.ns = makket neat út.+/- SEM-mjittingen foar 50 sellen wurde werjûn.Statistyske ferskillen waarden berekkene mei help fan Student's t-test.
(A) Skematyske fertsjintwurdiging fan ynhibysje en aktivearring fan 'e PI3K-AKT-paad, wêrtroch't respektivelik AJ-wizigingen en rêding resultearje.(B) Foarsteld model foar AKT-proteinstabilisaasje troch SPECC1L.
Premigratory CNCC's fereaskje AJ-lysis om te skieden fan anterior neurale fold neuroepitheliale sellen1,15,32.Ferhege kleuring fan AJ-komponinten en ferlies fan 'e apikaal-basale AJ asymmetryske distribúsje yn SPECC1L-deficiente sellen sawol yn vitro as yn vivo, kombineare mei de fysike tichtby fan SPECC1L nei β-catenin, suggerearje dat SPECC1L funksjonearret om AJ lokale stabiliteit goed te behâlden foar organisaasje spieren.actin cytoskelet.De assosjaasje fan SPECC1L mei it actin cytoskelet en β-catenin en de ferheging fan it oantal kondensearre actin filaments yn it ûntbrekken fan SPECC1L is konsekwint mei de waarnommen ferheging fan AJ tichtens.In oare mooglikheid is dat in ferhege oantal actin fezels yn SPECC1L-deficient sellen liedt ta in feroaring yn intercellular spanning.Omdat sellulêre stress beynfloedet AJ 33 dynamyk, spanning feroarings kinne resultearje yn mear diffuse AJ 34.Dat alle wizigingen sille ynfloed hawwe op de CNCC-lagen.
Wnt1 wurdt útdrukt yn 'e iere neuronale plooien dy't oanlieding jaan ta neural crest sellen.Sa markearret Wnt1-cre lineage tracing sawol foar- as migrearjende NCC35.Wnt1 markearret lykwols ek dorsale harsensweefselklonen dy't ek ôflaat binne fan iere neuronale plooien 35,36, wêrtroch it wierskynlik is dat ús kleuring fan E9.5-mutanten foar Wnt1-markers yn iepen neurale plooien net CNCC is.Us positive kleuring foar de NCC-markers AP2A en SOX10 befêstige dat de bleatstelde neurale plooien fan Specc11 mutante embryo's yndie CNCC befette.Dêrneist, sûnt AP2A en SOX10 binne markers fan iere migrearjende NCC, positive kleuring oanjûn dat dizze sellen binne post-migratory CNCC dat kin net wurde stratified troch E9.5.
Us gegevens suggerearje dat molekulêre regeling fan AJ troch SPECC1L wurdt bemiddele troch PI3K-AKT-sinjalearring.AKT-sinjalearring wurdt fermindere yn SPECC1L-deficiente sellen en weefsels.Befinings fan Fantauzzo et al.stypje in direkte rol foar PI3K-AKT-sinjalearjen yn kraniofasiale morfogenese.(2014) lieten sjen dat it ûntbrekken fan aktivearring fan PDGFRα-basearre PI3K-AKT-sinjalearring liedt ta in spjalte ferwulft fenotype.Wy litte ek sjen dat ynhibysje fan 'e PI3K-AKT-paad genôch is om AJ en selfoarm te feroarjen yn U2OS-sellen.Yn oerienstimming mei ús befiningen, Cain et al.37 liet sjen dat downregulation fan 'e PI3K α110-subunit yn endotheliale sellen resulteart yn in ferlykbere ferheging fan pericellular β-catenin-kleuring, oantsjutten as in ferheging fan' e "ferbiningsyndeks".Yn endotheliale sellen wêrfan de actin-filaminten al tige organisearre binne, resultearret ûnderdrukking fan 'e PI3K-AKT-paad yn in losse selfoarm.Yn tsjinstelling lieten SPECC1L-kd U2OS-sellen in langwerpige selfoarm sjen.Dit ferskil kin seltype spesifyk wêze.Wylst ûnderdrukking fan PI3K-AKT-sinjalearring permanint beynfloedet op it actin-cytoskelet, wurdt it effekt op selfoarm bepaald troch feroaringen yn spanning feroarsake troch feroaringen yn 'e tichtens en organisaasje fan sintrale actinfezels.Yn U2OS-sellen brûkten wy allinich selfoarmferoaringen as in marker fan SPECC1L-deficient AJ-feroaring en herstel.Ta beslút, wy hypoteze dat ynhibysje fan 'e AKT-paad yn SPECC1L-tekoart fergruttet AJ-stabiliteit en ferminderet delaminaasje yn CNCC.
Ynteressant waarden pan-AKT-nivo's in vitro en in vivo fermindere neist phosphorylated 473-AKT-nivo's yn 'e ôfwêzigens fan SPECC1L, wat suggerearret regeling fan PI3K-AKT-sinjalearjen op it nivo fan AKT-proteinstabiliteit as omset.De SPECC1L- en MID1-genen, beide ferbûn mei Opitz / GBBB-syndroam, kodearje proteïnen dy't mikrotubules stabilisearje 18,22.It meganisme wêrmei't SPECC1L en MID1 mikrotubule-stabilisaasje mediatearje is net folslein begrepen.Yn it gefal fan SPECC1L omfettet dizze stabilisaasje ferbettere acetylaasje fan in subset fan mikrotubules 18 .It is mooglik dat SPECC1L in ferlykber meganisme brûkt om oare aaiwiten te stabilisearjen lykas AKT.It is oantoand dat acetylaasje fan lysine-residuen yn it AKT-proteïne liedt ta in fermindering fan membraanlokalisaasje en phosphorylaasje38.Dêrnjonken is ubiquitinaasje fan 'e K63-keten op deselde lysine-residu op AKT fereaske foar syn membraanlokalisaasje en aktivearring39,40.Under ferskate faktoaren dy't ynteraksje mei SPECC1L aaiwiten identifisearre yn ferskate hege trochset gist twa-hybride skermen, fjouwer - CCDC841, ECM2942, APC en UBE2I43 - binne belutsen by protein omset as stabiliteit fia ubiquitination of sumoylation.SPECC1L kin belutsen wurde by post-translasjonele modifikaasje fan AKT-lysine-residuen, dy't ynfloed op AKT-stabiliteit.De krityske rol fan SPECC1L yn 'e lokalisaasje en stabiliteit fan it AKT-protein bliuwt lykwols te ferklearjen.
Swiere defekten yn SPECC1L-ekspresje yn vivo resultearren yn ferhege AJ-markerkleuring en defekte CNCC-overlay, lykas ek ferhege apoptose en iere embryonale letaliteit.Foarige rapporten hawwe oantoand dat mûzenmutanten mei ferhege nivo's fan apoptose ferbûn binne mei neuralbuisdefekten 44,45,46,47 en kraniofasiale defekten48.It is suggerearre dat oermjittige seldea yn 'e neuronale plooien of faryngeale bôgen kin resultearje yn in net genôch oantal sellen nedich foar goede morfogenetyske beweging 48,49,50.Yn tsjinstelling lieten ús SPECC1L-deficient sellenlinen mei matig fermindere SPECC1L-ekspresje allinich AJ-feroarings sjen sûnder bewiis fan ferhege selle-dea.Gemyske ynhibysje fan 'e PI3K-AKT-paad yn dizze Kd-sellen resultearre lykwols yn ferhege apoptose.Sa, in matige delgong yn SPECC1L ekspresje of funksje soarget foar it oerlibjen fan sellen.Dit is yn oerienstimming mei de observaasje dat seldsume Specc11 mutante embryos dy't ûntkomme oan arrest by st.E9.5-miskien troch fermindere gene capture effisjinsje-binne by steat om te sluten harren neural buizen en stopje letter yn ûntwikkeling, faak mei craniofacial defekten (Fig. S3).Ek yn oerienstimming mei dit is it seldsume foarkommen fan heterozygote Specc1l-embryo's mei kraniofasiale abnormaliteiten - wierskynlik troch ferhege effisjinsje fan genfangst - lykas de fynst yn sebrafisk wêryn ien fan 'e twa SPECC1L-ortologen (specc1lb) lette embryonale fenotypen feroarsaket, ynklusyf ferlies fan ûnderkaak en bilaterale spleten51.Sa kinne heterozygote SPECC1L-ferlies-fan-funksje-mutaasjes identifisearre yn minsklike pasjinten lytse beheiningen feroarsaakje yn SPECC1L-funksje tidens kraniofasiale morfogenese, genôch om har orofasiale spleten te ferklearjen.SPECC1L-basearre regeling fan ynterzellulêre kontakten kin ek in rol spylje yn palatogenese en fúzje fan 'e faryngeale bôgen.Fierdere stúdzjes fan SPECC1L-funksje sille helpe om de rol fan tydlike ynterzellulêre kontakten yn CNCC te ferklearjen by it sluten fan neurale buis yn neuroepitheliale selmotiliteit en kraniofasiale morfogenese.
U2OS osteosarcoma-kontrôle en SPECC1L-kd-sellen binne earder beskreaun (Saadi et al., 2011).Antistoffen tsjin SPECC1L binne ek earder karakterisearre (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antykladen (konijn; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mûs; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosine IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornje), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), knipte caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) en β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) waard brûkt lykas beskreaun..Actin filaments waarden kleurd mei Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS-kontrôlesellen en SPECC1L-kd-sellen waarden yn kultuer brocht yn standert hege glukoaze DMEM oanfolle mei 10% fetale bovine serum (Life Technologies, Carlsbad, CA).Foar AJ feroarings waarden 2 x 105 sellen sied op glês behannele mei 0,1% porcine gelatine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en waarnommen foar feroarings yn sel foarm.Sellen waarden sammele op ferskate oantsjutte tiidpunten: 4 oeren nei sied (t = 1), 24 oeren nei sied (t = 2), gearrin sûnder feroaring yn selfoarm (t = 3), feroaring yn selfoarm (t = 4) , 24 h nei sel foarm feroaring (t = 5) en 48 h nei sel foarm feroaring (t = 6) (fig. 1, 2, 3).Om de PI3K-AKT-paad te modulearjen, waarden sellen yn 'e oantsjutte konsintraasjes kweekt mei de PI3K-AKT-ynhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) of SC-79-aktivator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).It medium mei de gemikaliën waard alle dagen feroare.
Frame-by-frame opnames waarden makke op live kontrôle en KD sellen ûnder normale kultuer omstannichheden, en faze kontrast bylden waarden sammele elke 10 minuten foar 7 dagen.Ofbyldings waarden oankocht mei in komputer-kontroleare Leica DM IRB omkearde mikroskoop útrist mei in meganyske poadium en in 10 × N-PLAN-objektyf ferbûn mei in QImaging Retiga-SRV-kamera.Tidens ôfbylding waarden selkultueren op 37 ° C bewarre yn in fochtige sfear mei 5% CO2.
Twa genetrap ES-sellinen DTM096 en RRH048 fan it Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) waarden brûkt om Specc11-deficient mûslinen te generearjen, oanwiisd Specc1lgtDTM096 en Specc1lgtRRH046.Koartsein, 129 / REJ ES-sellen waarden ynjeksje yn C57BL6 blastocysts.De resultearjende chimeryske manlike mûzen waarden fokt mei froulike C57BL6-mûzen om neiteam te identifisearjen mei agouti-mantelkleur.De oanwêzigens fan gene trap-vektor-ynserts waard brûkt om heterozygoten te identifisearjen.Mûzen waarden hâlden op in mingde eftergrûn fan 129 / REJ; C57BL6.De lokaasje fan 'e ynfoegje-side fan' e genetyske trapfektor waard befêstige troch RT-PCR, genome-sekwinsje, en genetyske oanfolling (oanfoljende figuer 1).Om de CNCC-lineage fan dûbele heterozygote Specc1lGT-mûzen te spoaren, waarden ROSAmTmG (#007576) en Wnt1-Cre (#003829) mûzen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) oerstutsen om it ROSAmTmG en Wnt1-Cre-allele yn Specc1ol te produsearjen yn Specc1ol.Alle eksperiminten yn mûzen waarden útfierd neffens protokollen dy't goedkard binne troch de Ynstitúsjonele Komitee foar Animal Care and Use fan 'e University of Kansas Medical Center.
Embryos waarden fêst yn (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) foar 60 min by keamertemperatuer.Nei fixaasje yn X-gal kleuringsoplossing (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM kaliumferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% natrium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) Stainûntwikkeling waard útfierd by 37 ° C .°C binnen 1-6 oeren.Embryo's waarden post-fixed yn 4% PFA en visualisearre.
Foar Western blotting waarden sellen lysed yn passive lysis buffer (Promega, Fitchburg, WI) oanfolle mei in mingsel fan HALT protease inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysaten waarden ferwurke op 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX ready-made gels (Bio-Rad, Hercules, CA) en oerdroegen oan Immobilon PVDF membranen (EMD Millipore, Billerica, MA).De membranen waarden blokkearre yn 5% molke yn PBS mei 0,1% Tween.Antistoffen waarden nachts ynkubeare by 4 ° C of foar ien oere by keamertemperatuer.Femto SuperSignal West ECL reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA) waard brûkt foar sinjaalgeneraasje.Foar immunostaining waarden embryo's oernachtich fêststeld yn 4% PFA / PBS en cryopreserved.Tissue kryoseksjes waarden blokkearre yn PBS dy't 1% normaal geitenserum befette (Thermo Scientific, Waltham, MA) en 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en dan ynkubeare by 4 ° C yn in ynkubator tidens de nacht.mei anty-antibody en fluorescent sekundêr antykodym (1: 1000) foar 1 oere by 4 ° C.Stained seksjes waarden pleatst yn ProLong gouden medium (Thermo Scientific, Waltham MA) en platte bylden waarden krigen mei help fan in Leica TCS SPE confocal mikroskoop.Elke ymmunokleuring waard útfierd as trije ûnôfhinklike eksperiminten op cirossections fan op syn minst twa mutante embryo's.In represintatyf eksperimint wurdt toand.
Sellen waarden ynkubeare yn modifisearre RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, en HALT-protease-ynhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Koartsein, lysates waarden prepurified mei protein G magnetyske kralen (Life Technologies, Carlsbad, CA) en dan incubated oernachtsje by 4 ° C. mei anti-SPECC1L of IgG protein G protein kralen waarden brûkt om ekstrahearje SPECC1L en Western blotting waard útfierd mei help fan de anty -β-catenin antibody hjirboppe beskreaun De co-IP eksperiminten werjûn binne fertsjintwurdiger fan fjouwer ûnôfhinklike eksperiminten.
Fêste kweekte sellen as embryonale weefsels fan mûzen waarden levere oan it elektroanenmikroskopysintrum oan 'e Universiteit fan Kansas Medical Center.Koartsein waarden samples ynbêde yn EMbed 812-hars (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), oernachtich polymerisearre by 60 ° C, en yndield op 80 nm mei in Leica UC7 ultramikrotoom útrist mei in diamantblêd.Seksjes waarden fisualisearre mei in JEOL JEM-1400 transmissieelektronenmikroskoop útrist mei in 100 kV Lab6-pistoal.
Hoe kinne jo dit artikel oanhelje: Wilson, NR et al.Tekoart oan SPECC1L liedt ta ferhege stabiliteit fan spleatse gewrichten en fermindere delaminaasje fan kraniale neurale krystsellen.de wittenskip.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Ynduksje en differinsjaasje fan 'e neurale kryst.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Cranial neural crest sellen yn beweging: har rol yn craniofacial ûntwikkeling.American Journal of Medical Genetics.Diel A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurokristopathia: syn groei en ûntwikkeling oer 20 jier.Kinderarts.patology.laboratoarium.medisinen.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU, Noten MM. Breakthrough in the genetics of orofacial clefts.Trends in Molecular Medicine 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. en Riley, FM Molekulêre meganismen fan migraasje en patroanen fan kraniale neurale krystzellen by kraniofasiale ûntwikkeling.Untwikkeling 137, 2605-2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH, en Murray, JK.natuerlike kommentaar.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Abnormale morfogenese fan 'e hûd, limbs en kraniofasjale regio yn interferon-regulearjende faktor-6 (Irf6) -deficient mûzen.Nasjonale Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominante mutaasjes yn GRHL3 feroarsaakje Van der Waard syndroom en beynfloedzje ûntwikkeling fan de orale periderm.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ en Juriloff, DM Update de list fan mûsmutanten mei defekten yn sluting fan neuronale buis en foarútgong nei in folslein genetysk begryp fan sluting fan neuronale buis.Ûndersyk fan berte mankeminten.Diel A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha-sinjalearring regelet oerlibjen en proliferaasje yn skeletale ûntwikkeling troch in p53-ôfhinklike intrazellulêre paad.Gene Development 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND en Murdoch, JN.Trends yn neurology.26, 453-455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).